基于多重RT-PCR技术检测新疆甜瓜主栽区3种病毒病及其分布

采用同源克隆的方法,从新疆感染病毒病的甜瓜中克隆获得WMV、CMV、ZYMV 3种病毒CP蛋白基因的部分片段。并基于单重RT-PCR扩增条件,采用单因素分析法,优化所获得多重RT-PCR的反应体系,利用多重PT-PCR体系对48份供试样品检测。结果表明,多重RT-PCR的检测结果与单重RT-PCR结果一致,说明构建的多重RT-PCR体系具有一定准确性和稳定性,可以用于WMV、CMV、ZYMV 3种病毒的快速检测、病源鉴定、阳性筛选等研究。通过分析甜瓜主要种植区病毒病的多重RT-PCR检测结果,初步得出新疆甜瓜主栽区3种病毒的分布现状与侵染形式,从而为病毒病的防治工作提供依据,以期对新疆瓜果生产中病毒防治,田间检测,流行病学调查以及抗病毒病甜瓜育种等研究提供相应的理论基础与依据。     

基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究

CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明, 2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。     

基于ISSR的葡萄品种亲缘关系分析及其指纹图谱构建

以19份葡萄品种为材料,采用ISSR分子标记对其品种间的亲缘关系进行研究,通过非加权配对算术平均法（UPGMA）进行数据分析,建立亲缘关系图,利用筛选出的引物构建葡萄品种的DNA指纹图谱。结果表明,从86条ISSR引物中筛选出14条多态性较丰富且稳定的引物,共扩增出136条带,其中多态性条带125条,多态性百分率为91．91％。各材料间遗传相似系数在0．54～0．83,平均遗传相似系数为0．685。在遗传相似系数为0．54时,可将19份葡萄材料明显分为2大类。利用2条ISSR引物UBC815和UBC855构建了14个葡萄品种的DNA指纹图谱。分析表明,ISSR标记多态性较为丰富,适合葡萄品种亲缘关系分析及图谱构建,并可为品种鉴定提供理论依据。     

侵染新疆甜瓜的ZYMV衣壳蛋白基因克隆及其序列分析

新疆作为中国有名的瓜果之乡,其瓜类不仅成为其中最具代表性的品牌也日益成为农民增收致富的经济支柱产业.然而近年来由于新疆瓜果日益受到病毒病威胁,严重时造成大面积减产甚至绝收,大幅度制约了农民生产积极性和生活水平的提高.小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaicvirus,ZYMV)是其中比较具有代表性的病毒,为了对新疆不同主栽地区甜瓜(Cucumis melo) ZYMV进行生物防治和抗病毒甜瓜的研究.本研究利用同源克隆的方法,扩增获得了新疆19个样点ZYMV分离物衣壳蛋白(coat protein,CP)基因全长序列,ZYMV分离物CP基因全长介于1 080～1 180 bp,编码253～301个氨基酸,蛋白质大小约33 kD.序列比对发现,ZYMV核酸序列的3'和5'非编码区末端保守性较低,编码区及其周围序列保守性较高,氨基酸序列的N端保守性高于C端.ZYMV同源性比对结果发现,病毒属于同一ZYMV基因型.通过核酸序列构建的分子进化树可以将ZYMV分为4个亚组,亚组分离依据符合地区分布特性.根据对蛋白质理化性质,包括蛋白质的动力学、化学和热力学稳定性分析得出,ZYMV均属于稳定性蛋白.结合新疆夏季平均降水量和平均气温变化趋势发现,其与对应地区ZYMV CP的疏水性指数和脂溶性指数的变化趋势存在一定相关性.分析认为,不同地区ZYMV CP的稳定性存在一定的差异,这可能与新疆特殊的气候条件与分离物所处地理环境有关.本研究通过序列分析获得19个样点ZYMV CP核酸序列以及CP特征,为今后以RNA干扰技术或基因组编辑技术培育抗病毒甜瓜,进行生物农药研发等提供了基础的数据支持,同时为开展对植物病毒的致病机理以及探究环境与病毒传播机制的研究提供初期的研究方向.     

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。     

棉花U3和U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定

【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。     

拟南芥ROP2与GGB蛋白互作的分析

为了阐明拟南芥ROP蛋白家族成员ROP2与蛋白异戊二烯化中I型香叶酰基的β亚基GGB的互作关系,本研究先后采用酵母双杂交和三杂交技术分析了两者之间的相互作用。结果表明,ROP2与GGB之间在酵母细胞中并没有发生相互作用。我们又采用双分子荧光互补(BiFC)技术在植物体内再次验证两者之间的相互作用。重新构建了一套带多克隆位点的常规BiFC重组表达载体,基于这套BiFC载体,进行了验证分析。结果表明,实验组在本氏烟草的表皮细胞中发现了黄色荧光信号,并且信号定位在细胞膜上,而阴性对照组未发现荧光信号,说明GGB蛋白与ROP2蛋白在植物体内存在相互作用,并且这种相互作用发生在细胞膜上。本研究结果为进一步揭示ROP2的生化调控机制奠定了前期基础。     

不同截短U3启动子在棉花中的功能分析

从海岛棉中克隆了2种GbU3-2P、GbU3-3P启动子,对它们进行2种长度截短,长度分别为436、245 bp和384、233 bp,同时构建了4个相应启动子驱动GUS的融合植物表达载体。利用农杆菌真空渗透转化法将4个GbU3Ps∷GUS-sg RNA-P1300植物表达载体分别转染棉花胚性愈伤组织。经GUS组织化学染色显示:克隆得到的2种截短大小的GbU3-2P和GbU3-3P启动子均能驱动GUS基因在棉花愈伤组织中表达,棉花愈伤组织被染成蓝色,但颜色深浅没有显著差异。本研究表明,同一GbU3启动子截短后,较短的启动子和较长的启动子具有相同的转录活性。这为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了更多理想的启动子。     

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。