棉花U3和U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定

【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。     

一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM (proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)编码氨基酸(1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V, 1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q, 1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%～70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%～70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。     

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。     

中国农科院植保所首创应用ScCas9对水稻进行基因组定点编辑

<正>近日,中国农业科学院植物保护研究所作物有害生物功能基因组研究创新团队首次将Sc Cas9蛋白应用于水稻细胞基因位点识别和定点编辑,证实在水稻中有较高的编辑效率,可识别PAM序列NNG基因位点,扩宽了植物基因编辑应用范围。据周焕斌研究员介绍,CRISPR/Cas9系统已成为基因组精准     

CRISPR/Cas9系统在作物基因组编辑中的研究进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑,由于该技术简便、高效的特点,在作物基因组编辑中被广泛使用。本研究主要对CRISPR/Cas9系统的组成与分类,工作原理以及g RNA构建方法进行了系统的介绍,并针对该系统存在的脱靶效应,总结了相应策略。同时,总结了在作物基因组编辑中CRISPR/Cas9系统的应用及研究进展情况,并对CRISPR/Cas9系统在作物基因编辑研究的方向做了展望,为作物的基因功能研究和分子设计育种提供参考。     

番茄CRISPR/Cas9抗双生病毒系统的快速验证分析

双生病毒是一类全世界范围内普遍存在的单链环状DNA病毒,其中菜豆金色花叶病毒属的病毒种类数量最多,危害最大。近年来,CRISPR/Cas9基因组编辑技术快速发展,已被用于植物抗病毒工程中。然而,CRISPR/Cas9系统中并不是所有的靶向序列都能成功完成基因组编辑,进而实现抗病毒的效果。本研究通过病毒基因组序列比对分析发现菜豆金色花叶病毒属各类病毒基因组上存在一个高度保守位点,位于复制起始蛋白(Rep)基因中。以该保守序列作为CRISPR/Cas9系统的靶序列,通过瞬时转化的方法,在本式烟草中快速验证该病毒靶序列的抗病毒效果。结果显示,本研究成功构建了针对双生病毒基因组的编辑系统,通过瞬时转化烟草后有效地抑制了病毒的积累,验证了该靶序列抗病毒的有效性,为后续基于CRISPR/Cas9基因组编辑技术在稳定转化番茄上实现对双生病毒的广谱抗性奠定基础。     

利用可视化CRISPR/Cas9系统获得拟南芥Cas9-free突变体

CRISPR/Cas9是实现基因精准突变的有效工具而被广泛应用到功能基因组学研究中。通常需要在已编辑后代的基因组中剔除此编辑体系,以防Cas9进一步编辑导致复杂的脱靶效应。本研究利用可视化的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除拟南芥AtPAE4基因,测序结果显示AtPAE4在第一个外显子的第478号碱基前面插入了一个碱基A,导致氨基酸的移码突变而提前终止。利用种皮特异启动子控制表达的m Cherry荧光蛋白,可以在T_1代纯合突变体种子群体中分别鉴定出发荧光和不发荧光的种子家系,抗性筛选及分子检测发现不发荧光家系为Cas9-free的AtPAE4突变家系。对AtPAE4突变体的根、茎、叶进行qPCR分析发现AtPAE4在根、茎、叶上的转录水平均显著下调。这些结果表明可视化CRISPR/Cas9系统在基因编辑后代中可快速鉴定到Cas9-free突变体植株,这有助于为进一步研究靶基因功能而获得背景清晰的编辑材料。     

靶向BnSVP的CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。     

遗传发育所在小麦DNA-free基因组编辑方法研究中取得进展

<正>CRISPR/Cas9是目前应用最为广泛的基因组编辑技术,已在作物基因功能研究以及品种改良中取得了巨大的成功。常规植物基因组编辑手段多通过农杆菌或基因枪的方法将CRISPR/Cas9DNA表达框转入并整合到植物基因组中,进而发挥功能对目的基因进行编辑。但是这些方法多存在许多不足,如较高的潜在脱靶效应、易出现嵌合体、     

基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T_0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T_1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T_1不含荧光的种子进行培育得到的T_2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。     

棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定

U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件, 而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166bp), 采用Transfer PCR方法成功地截出6个长度不同的U6启动子, 其长度分别为672、468、358、280、202和105bp, 并分别构建了6个启动子驱动的GUS融合植物表达载体。将构建好的6个GbU6-5Ps::GUS-pCAMBIA1300与初始克隆的GbU6-5P::GUS-pCAMBIA1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS组织化学染色显示, 克隆到的7个不同截短大小的GbU6-5Ps启动子均能驱动GUS基因在棉花花粉中转录, 棉花花粉被染成蓝色但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短, 其转录活性越高。而且另外两种棉花U6启动子GbU6-1P和GbU6-7P也表现出类似的结果。本研究克隆了3个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的GbU6启动子。结果显示更短的U6启动子具有更高的转录活性, 而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。这预示着使用更短U6启动子不仅符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求, 而且会提高sgRNA的转录水平, 进而可能提高基因组编辑效率。     

Functional Identification of Cotton U3 and U6 Promoters in the CRISPR/Cas9 Genome Editing System

[Objective] The function of U3 and U6 promoters that were cloned from sea-island cotton were identified in order to provide more available U3 and U6 promoters for the construction of cotton CRISPR/Cas9 multi-sites gene editing system. [Method] Two CRISPR/Cas9 gene editing vectors were constructed, in which sgRNA were driven by GbU6-7P and GbU3-2P, respectively, and GGB, a negative regulator in drought tolerance, was used as target gene. The function of the vector were identified in cotton leaf protoplast of Xinhai 16. The core fragment of CRISPR/Cas9 gene editing vector were enriched by Polymerase chain reaction method and were delivered into protoplast through PEG transient transformation. Then genomic DNA were extracted from protoplast. Gene mutations were analyzed using Enzyme digest/Polymerase chain reaction and sequenced. Finaly the mutation efficiencies of the CRISPR/Cas9 system were calculated and the frequency distribution of the mutation in target site were drawn in order to confirm the authenticity of the mutation. [Result] All type of mutation in target loci were base substitution. [Conclusion]Both CRISPR/Cas9 gene editing systems based on GbU3-2P and GbU6-7P promoters could successfully edit the sequence of cotton GGB gene and cause gene mutation.     

不同截短U3启动子在棉花中的功能分析

从海岛棉中克隆了2种GbU3-2P、GbU3-3P启动子,对它们进行2种长度截短,长度分别为436、245 bp和384、233 bp,同时构建了4个相应启动子驱动GUS的融合植物表达载体。利用农杆菌真空渗透转化法将4个GbU3Ps∷GUS-sg RNA-P1300植物表达载体分别转染棉花胚性愈伤组织。经GUS组织化学染色显示:克隆得到的2种截短大小的GbU3-2P和GbU3-3P启动子均能驱动GUS基因在棉花愈伤组织中表达,棉花愈伤组织被染成蓝色,但颜色深浅没有显著差异。本研究表明,同一GbU3启动子截短后,较短的启动子和较长的启动子具有相同的转录活性。这为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了更多理想的启动子。     

CRISPR/Cas基因编辑系统及其在植物中的研究进展

靶向基因编辑系统是一种研究植物基因功能的工具。其中,CRISPR/Cas基因编辑系统的克隆策略相对简单,成本低廉,因而在生物学界获得了广泛的关注。为了更好地对其在植物中进行研究,笔者介绍了该系统的基本结构特征与作用机理,归纳了在拟南芥、烟草、水稻等植物中对该系统进行的报道,分析了该系统尚需改进的问题如脱靶效应,探讨了多种解决方法,如优化sgRNA序列长度、利用双Cas9切口酶、合成fCas9复合体以及应用RFNs二聚体等,以降低脱靶效应。     

CRISPR/Cas9系统及其在粮油作物遗传改良中的研究进展

CRISPR是细菌或古生菌对入侵到体内的病毒,通过核酸特异性识别、Cas9蛋白酶切割产生的一种天然免疫系统。基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术,通过sgRNA介导和Cas9蛋白切割实现对靶基因的定点编辑。因其操作简便、编辑效率高、适用范围广的特点,迅速成为研究植物、动物、微生物基因功能的重要手段。同时,随着大量基因组信息和相应数据库的广泛建立,CRISPR/Cas9技术利用反向遗传学,配合生物信息技术,成为遗传改良、创新特异种质的一种极有效的新手段。本文主要对CRISPR/Cas系统的基本原理、CRISPR/Cas9基因编辑技术的作用机制,以及CRISPR/Cas9技术在粮油作物遗传改良、品种选育研究中取得的进展进行了综述,为遗传育种工作者利用该技术进行遗传改良和品种优化升级育提供有效的参考。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在作物品种改良中的应用

基因组编辑技术是用特殊的核酸酶对基因组进行精准修饰的一种新兴技术。2013 年研究人员发现了CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统,将其中的CRISPR/Cas9 系统成功改造成RNA引导的核酸内切酶,发展了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术。该技术能够对包括植物在内的几乎所有物种的基因组进行高效、精准的定点修饰,而且程序简易、操作方便灵活,加速了遗传工程、功能基因组学的研究,给生命科学的各个领域带来了革命性变化。本综述回顾了CRISPR/Cas9 的出现、改进与发展,简述了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术的作用机理,归纳总结了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术在作物品种改良、提高作物品质和产量中的应用,最后,分析了该技术在作物品种改良中的发展前景及应用价值,以期为合理利用该技术进行种质创新、品种改良提供理论依据。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsCOL9水稻突变体

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。     

CRISPER/Cas9系统在植物基因组定点修饰及作物遗传育种中的应用研究进展

CRISPR/Cas9系统是一项简单、高效的基因定点编辑技术,在植物遗传改良及作物良种选育等方面具有重要的应用价值。本研究主要介绍了CRISPR/Cas9的原理及构建方法,论述了近年来CRISPR/Cas9技术在植物基因功能及基因表达调控、植物基因组的定向编辑以及作物分子育种中的应用及研究进展,分析了该基因编辑系统的主要影响因素及优化改进方式,探讨了该系统在应用中的问题及解决途径并对今后发展方向进行了展望,为该技术在植物基因组定点编辑及作物遗传育种等领域研究提供参考。