基于CRISPR/Cas9系统构建拟南芥EXPA多基因编辑表达载体

CRISPR/Cas9系统是一种由sg RNA及Cas9核酸酶组成的适应性免疫系统,已被成功运用于多种植物基因组编辑。扩展蛋白(expansin, EXP)是一类可以使细胞壁伸展和松弛的细胞壁蛋白,对植物的各个组织生长发育都有着重要的作用,由EXPA、EXPB、EXLA和EXLB 4个不同的基因家族组成。本研究以拟南芥的EXPA基因为例,通过CRISPR/Cas9系统构建拟南芥EXPA多基因编辑的表达载体,并利用农杆菌介导CRISPR/Cas9表达载体的方法转化拟南芥,以创制拟南芥扩展蛋白多基因突变体,为后续的研究提供突变体材料。     

甘蓝型油菜BnaABI4基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建及甘蓝型油菜转化

ABI4(Abscisicacid-insensitive4)是ABA响应途径中重要的转录因子。本研究以甘蓝型油菜全基因组数据库为基础,借助拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,通过序列比对,获得了甘蓝型油菜的2个BnaABI4,分别命名为BnaABI4-A (GenBank登录号为BnaA03g18970D)和BnaABI4-C (GenBank登录号为BnaC03g725-10D)。在这两个基因的CDS序列上寻找一段长度为20 bp、序列相同的片段作为基因编辑的目标位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1300-sg RNA/Cas9-BnaABI4;借助根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法,成功将BnaABI4的基因编辑表达框转入甘蓝型油菜‘湘油15’中,共获得转基因植株13株,这将为深入研究甘蓝型油菜BnaABI4的生物学功能提供科学依据。     

棉花U3和U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定

【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。     

CRISPR/Cas9植物基因编辑系统敲除棉花GhSBP基因表达载体的构建

基因编辑技术是研究基因功能的一个有效工具。CRISPR/Cas9系统是基于细菌Ⅱ型免疫系统改造而成的一种全新的基因编辑系统。因其相对于ZFNs、TALENs更加简单高效,适用于普通分子生物学实验室。各种植物特异的CRISPR/Cas9载体被构建并快速应用于多种植物中。本实验以棉花GhSBP基因为编辑对象,构建了CRISPR/Cas9系统敲除GhSBP基因的表达载体,并利用农杆菌介导法转化棉花,以期获得敲除GhSBP基因的棉花转基因株系。     

CRISPR/Cas9系统在作物基因组编辑中的研究进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑,由于该技术简便、高效的特点,在作物基因组编辑中被广泛使用。本研究主要对CRISPR/Cas9系统的组成与分类,工作原理以及g RNA构建方法进行了系统的介绍,并针对该系统存在的脱靶效应,总结了相应策略。同时,总结了在作物基因组编辑中CRISPR/Cas9系统的应用及研究进展情况,并对CRISPR/Cas9系统在作物基因编辑研究的方向做了展望,为作物的基因功能研究和分子设计育种提供参考。     

遗传发育所在小麦DNA-free基因组编辑方法研究中取得进展

<正>CRISPR/Cas9是目前应用最为广泛的基因组编辑技术,已在作物基因功能研究以及品种改良中取得了巨大的成功。常规植物基因组编辑手段多通过农杆菌或基因枪的方法将CRISPR/Cas9DNA表达框转入并整合到植物基因组中,进而发挥功能对目的基因进行编辑。但是这些方法多存在许多不足,如较高的潜在脱靶效应、易出现嵌合体、     

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。     

中国鹅掌楸纤维素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系统的gRNA表达载体构建

CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。本研究以中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)为研究对象,首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)gRNA(guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,以LcCESA1基因外显子5'端的第一个外显子区域的GN19NGG序列设计gRNA引物;以p201N-Cas9为载体,Gibson Assembly誖Master Mix为连接酶,通过Gibson Assembly连接技术,将CESA1-gRNA连入p201N-Cas9中,获得p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体。根据载体中插入序列,设计了两对检测引物,经PCR鉴定,均获得了相应大小的序列;测序分析进一步证实确认gRNA已经完整准确地连入载体。p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体能对CESA1基因进行定向编辑,对后续研究鹅掌楸纤维素合酶的基因功能具有重要意义。     

CRISPER/Cas9系统在植物基因组定点修饰及作物遗传育种中的应用研究进展

CRISPR/Cas9系统是一项简单、高效的基因定点编辑技术,在植物遗传改良及作物良种选育等方面具有重要的应用价值。本研究主要介绍了CRISPR/Cas9的原理及构建方法,论述了近年来CRISPR/Cas9技术在植物基因功能及基因表达调控、植物基因组的定向编辑以及作物分子育种中的应用及研究进展,分析了该基因编辑系统的主要影响因素及优化改进方式,探讨了该系统在应用中的问题及解决途径并对今后发展方向进行了展望,为该技术在植物基因组定点编辑及作物遗传育种等领域研究提供参考。     

基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究

CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明, 2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。     

CRISPR/Cas9系统及其在粮油作物遗传改良中的研究进展

CRISPR是细菌或古生菌对入侵到体内的病毒,通过核酸特异性识别、Cas9蛋白酶切割产生的一种天然免疫系统。基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术,通过sgRNA介导和Cas9蛋白切割实现对靶基因的定点编辑。因其操作简便、编辑效率高、适用范围广的特点,迅速成为研究植物、动物、微生物基因功能的重要手段。同时,随着大量基因组信息和相应数据库的广泛建立,CRISPR/Cas9技术利用反向遗传学,配合生物信息技术,成为遗传改良、创新特异种质的一种极有效的新手段。本文主要对CRISPR/Cas系统的基本原理、CRISPR/Cas9基因编辑技术的作用机制,以及CRISPR/Cas9技术在粮油作物遗传改良、品种选育研究中取得的进展进行了综述,为遗传育种工作者利用该技术进行遗传改良和品种优化升级育提供有效的参考。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsIPCS家族基因突变体

肌醇磷酸神经酰胺合酶(inositol phosphoryl ceramide synthase,IPCS)是植物鞘脂合成途径中的一种关键酶,在植物生长发育和逆境适应中具有重要作用。本研究在OsIPCS基因外显子区域设计带有PAM序列的靶位点,利用PCR扩增获得OsIPCS基因sg RNA表达盒,并成功构建CRISPR/Cas9敲除载体;采用根癌农杆菌介导的遗传转化获得3个OsIPCS基因的T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序确定突变类型,其中2株不同突变类型的OsIPCS1突变单株,27株不同突变类型的OsIPCS2突变单株,9株不同突变类型的OsIPCS3突变单株,为进一步开展OsIPCS基因功能的研究提供科学依据。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用

作为传统基因工程育种技术,转基因技术在植物分子育种工作中的应用受到技术本身缺陷及其他风险因素的限制。CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术。本研究介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术的基本原理和研究进展,分别比较分析了CRISPR/Cas9系统与前两代基因编辑技术(ZFNs和TALENs)和传统转基因技术之间的差异。至今为止,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种植物中实现了定点突变诱导(插入,缺失或修饰等)。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点,CRISPR/Cas9系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段,应用前景十分广阔。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在作物品种改良中的应用

基因组编辑技术是用特殊的核酸酶对基因组进行精准修饰的一种新兴技术。2013 年研究人员发现了CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统,将其中的CRISPR/Cas9 系统成功改造成RNA引导的核酸内切酶,发展了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术。该技术能够对包括植物在内的几乎所有物种的基因组进行高效、精准的定点修饰,而且程序简易、操作方便灵活,加速了遗传工程、功能基因组学的研究,给生命科学的各个领域带来了革命性变化。本综述回顾了CRISPR/Cas9 的出现、改进与发展,简述了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术的作用机理,归纳总结了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术在作物品种改良、提高作物品质和产量中的应用,最后,分析了该技术在作物品种改良中的发展前景及应用价值,以期为合理利用该技术进行种质创新、品种改良提供理论依据。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因tgw6突变体的创建

利用CRISPR/Cas9技术对调控水稻产量千粒重基因TGW6定点编辑,获得了一套有重要育种价值的tgw6突变体。设计了分别由U3、U6a和U6b启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑TGW6基因的外显子,首先将这3个靶点一起组装到pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体上,然后利用农杆菌介导侵染水稻材料H447 (R819/玉针香//R819的BC₃F₆);提取T₀代转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明,T₀代材料中tgw6的突变频率高达90%,其中纯合缺失突变率约占51%。对T₁代纯合缺失突变体的千粒重性状的调查分析结果表明,部分tgw6的缺失突变能显著提高千粒重(大于5%)。不同类型tgw6突变体的成功创建不仅丰富了tgw6的变异类型,为水稻的高产稳产奠定了重要的材料基础,还证实了CRISPR/Cas9技术在水稻基因工程育种中高效、易操作的特点,具有重要的理论与实践意义。     

CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑文库筛选在植物中的应用

CRISPR/Cas9系统通过对基因的定向编辑,对基因组编辑产生了革命性的影响,成功促进了突变体筛选在基因组水平上的新发展。虽然该系统构建突变体文库速度快,针对性强,且具有巨大的应用前景,目前在一些重要作物的研究中已取得了重要进展,但其在木本植物中的应用仍处于初级阶段。本研究总结了CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑文库构建方面的应用,探究该系统如何应用于构建突变敲除体库。将构建基因编辑突变体文库作为深入研究基因功能的手段,本研究综述的信息将对推进木本植物相关研究提供有益的借鉴。     

CRISPR/Cas9技术在作物基因功能研究和育种中的应用

CRISPR/Cas是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫防御系统,目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,其中Ⅱ型系统的组成较简单,由其改造成的CRISPR/Cas9技术已成为一种便捷、高效的基因组编辑工具,广泛地应用于动物、植物、微生物等基因功能和遗传改良研究。本研究主要介绍了CRISPR/Cas9的组成和原理,及其在作物基因功能研究和育种中的应用,并对其进一步在作物遗传改良中的发展进行了探讨。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥MS2基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9)基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场重大的技术革命,它比锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用到植物科学研究领域中。本实验选取拟南芥MS2为目的基因,构建植物基因编辑系统的表达载体,并通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,从而利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除拟南芥MS2基因。对转基因后代的MS2测序结果分析表明,在获得的12个阳性转化植株中,发现了5个阳性植株存在基因序列上的新碱基插入,由此形成CRISPR/Cas9介导的拟南芥MS2突变体。这一工作为后续分析其他物种中MS2同源基因的功能研究提供参考依据。