靶向BnSVP的CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。