人基质蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域原核表达优化

用构建的人基质蛋白酶-2（MMP-2）类血红素结构域原核表达载体PET25b—PEX转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性菌落LB液体培养基培养，异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达产生的表达蛋白，大小约29kD，与预期大小相符。设置不同的IPTG诱导终浓度，诱导时间，诱导时菌液OD值和LB液体培养基的pH值，SDS-PAGE电泳和软件分析发现，当IPTG浓度为0．7mmol／L，诱导4h，诱导时菌液OD值为0．7时，实验能获得最高的PEX蛋白表达；5L大规模培养时，LB培养基pH值为7．5时，可获得较高的重组PEX蛋白表达。     

生长素结合蛋白AtTIR1和IAA28的原核表达及纯化

以pGEX–KG为骨架,运用分子克隆方法构建了生长素结合蛋白AtTIR1和 IAA28的原核表达载体,通过转化不同表达菌株探索了2种蛋白的诱导表达条件。结果表明：在0.4 mmol/L IPTG诱导下,GST–IAA28融合蛋白在表达菌株Tuner中的表达量最高,其适宜诱导温度为16 ℃;在0.6 mmol/L IPTG诱导下,BL21(DE3)中GST–IAA28的表达量最高;在各种浓度的IPTG诱导下,Rosetta中的GST–IAA28的产量均不高;在25 ℃和0.4 mmol/L IPTG诱导条件下,Rosetta中的GST–AtTIR1表达总量最高,每克细菌可诱导出约0.2 mg的目标蛋白,但BL21(DE3)菌种中的GST–AtTIR1表达量很低。利用GST SefiroseTM resin亲和树脂对表达的蛋白进行纯化,获得了较纯的AtTIR1和IAA28蛋白。     

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白(N)重组表达条件的优化

为获得更高含量的可溶性N蛋白,对构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-32a-N)的表达条件(如诱导温度、诱导时间、IPTG浓度)进行了优化.结果表明:N蛋白最佳诱导表达条件为18℃诱导17h、IPTG浓度0.2 mmol/L;优化后可溶性N蛋白的表达量为22.1 mg/L,比优化前37℃、IPTG浓度1.0 mmol/L条件下诱导4h提高了58.5％.     

蜡梅nsLTPs基因家族4个成员的原核表达研究

[目的]利用现代分子生物学技术探索蜡梅（Chimonanthus praecox）资源的药用价值。[方法]在有关蜡梅生物学特性研究基础上,构建蜡梅非特异性脂转移蛋白（nsLTP）基因家族4个成员（GenBank登录号：FJ889521、FJ904082、FJ904083、FJ904084）的原核表达载体CpLTP1-pET、CpLTP2-pET、CpLTP3-pET、CpLTP4-pET,并对诱导温度、IPTG浓度和诱导表达时间等条件进行了优化。[结果]在1.0mmol/L IPTG、37℃常规诱导条件下诱导6 h可获得高效表达,总表达产率可达到细菌全蛋白质总量的50%以上,包涵体表达远高于可溶性蛋白的表达;在0.5 mmol/L IPTG、28℃条件下诱导6 h能够获得较好的可溶性表达,利用His-Bind蛋白纯化回收试剂盒获得4个纯化的重组蛋白。[结论]成功构建蜡梅nsLTP的原核表达载体,转化大肠杆菌Origami2（DE3）获得4个纯化的重组蛋白,可为后续的抗菌抗病毒活性研究提供研究材料,并为蜡梅资源药用价值的开发提供研究思路。     

拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达研究

[目的]研究拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达.[方法]构建XCD1原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,并以PCR扩增得到大量目的片段XCD1,将XCD1连接到原核表达载体pET-32a＋,并对重组质粒进行测序鉴定,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21（DE3）,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.IPTG诱导表达获得目的蛋白,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.[结果]XCD1序列全长为1 242bp,与PCR产物大小一致.蛋白XCD1-pET-32a＋较适表达条件为在30℃0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5h.[结论]该结果为进一步蛋白纯化及酶活测定试验奠定了基础.     

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30的原核表达与抗体制备

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30(Momordica charantia antiviral protein 30)是苦瓜中一种具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性的蛋白质.将舍有重组表达质粒pET-28(a)-MAP30的大肠杆菌BL21进行诱导表达获得了重组蛋白MAP30,对IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导浓度、诱导时间表达条件的分析表明,工程菌经0.2mmol·L~(-1) IPTG诱导6 h实现高效可溶性表达.利用镍离子鏊合亲和层析对重组蛋白纯化,当洗脱液中咪唑的浓度为100 mmol·L~(-1)时,目的蛋白被洗脱的效果最好.将纯化后的重组蛋白免疫家兔,获得了特异性的多克隆抗血清.     

抗自溶烟草蚀纹病毒蛋白酶的原核表达和纯化及活性分析

利用QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit将自溶性烟草蚀纹病毒蛋白酶（tobacco etch virus Protease,TEVP）219位的Ser（S）突变为Val（V）,经测序验证的S219V突变质粒pMAL TEVPS219V电转化大肠杆菌BL21 Star（DE3）,并优化异丙基硫代β D半乳糖苷（IPTG）诱导浓度、温度、时间对TEVP表达的影响。结果表明,突变的TEVP 表达最适条件为24 ℃,0.75 mmol/L IPTG诱导11 h。经金属离子螯合层析纯化得到高纯度,高活性的突变TEVP蛋白酶,比活力为1 048 U/mg。每升菌液可纯化17.2 mg目标蛋白。     

鸡β 防御素Gal 3在大肠杆菌中的诱导表达

利用 IPTG 作为诱导剂进行鸡β 防御素 3 基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。分别对影响重组蛋白表达的因素（IPTG浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和溶氧量）进行优化,最终得到最佳的IPTG诱导条件： IPTG的终浓度为0.6 mmol/L，诱导起始吸光度A₆₀₀为0.6，最适溶氧量为150 mL 三角瓶装50 mL培养基，且在 33 ℃ 下诱导4 h 重组蛋白表达量达到最大。该方法为工程化生产提供良好的试验依据。     

绿色荧光蛋白（GFP）基因克隆及其表达培养基的筛选

为应用PET15b-GFP观察细胞内部结构等其他功能奠定基础，研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein,GFP）的基因克隆及其在不同种培养基条件下不同种感受态大肠杆菌细胞中的表达情况，通过克隆提纯PET15b-GFP质粒，将已插入单链抗体3E3和152的重组质粒pET15b-3E3-GFP和pET15b-152-GFP，运用转化的方法将重组质粒分别导入感受态的大肠杆菌细胞中（BL21，B cell，K12），在不同的培养基条件下使用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GFP基因进行表达，筛选出表达最好的并改良表达能力最弱表达条件。结果表明：重组质粒pET15b-152GFP-BL21在液态LB培养基中30℃、0.4mmol/L IPTG、180rpm诱导条件下培养显色最显著，在固态富集酵母培养基中30℃，1mmol/L诱导条件下培养显色最显著；表达能力最弱的重组质粒pET15b-152-GFP-B cell在富集酵母液体培养基中25℃、180r/min、0.4mmol/L IPTG的条件下诱导培养表达绿色荧光最显著；pET15b-152-GFP-B cell在0 mmol/L、0.1mmol/L、0.4mmol/L和1mmol/L IPTG的诱导条件下表达绿色荧光无显著差异。     

猪流行性腹泻病毒重组M蛋白膜外区原核表达IPTG最佳诱导条件的确定

将猪流行性腹泻病毒编码M蛋白囊膜外区的基因片段（M’）亚克隆后，构建重组质粒pGEX-6p-M’并转化大肠杆菌以不同浓度IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明，在以浓度为0．3-0．5mmol／L的IPTG诱导6h条件下pGEX-6p-M’获得了最高效表达。     

枣树ZjAPX基因的原核表达

为了解枣树抗氧化系统中抗坏血酸过氧化物酶基因的作用和功能,将从枣树结果枝cDNA文库中筛选获得的ZjAPX cDNA序列,连接到原核表达载体pGEX-4T-2,导入E.coli体内进行了表达产物鉴定。SDS-PAGE电泳检测表明,1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h表达了蛋白产物;IPTG的浓度和诱导时间优化表明,1.2 mmol/LIPTG诱导5 h时,蛋白的表达量最大。研究为枣抗坏血酸过氧化物酶基因生物学功能的深入研究奠定了基础。     

Taq DNA聚合酶制备技术的优化

以酶蛋白表达量、酶活性和比活性为指标 ,从工程菌菌株、转化方法、诱导表达时间、诱导剂浓度 4个方面 ,对TaqDNA聚合酶制备技术进行了优化筛选。用JM 1 0 9菌株制备的总酶活力高于DH5α ,电击法的转化率高于热激法 ,用 1 0mmol/LIPTG诱导 1 2h ,酶蛋白表达量、酶活性和比活性均显著高于其他浓度和时间的处理。SDS PAGE电泳和PCR扩增结果表明 ,用优化技术制备的TaqDNA聚合酶 ,纯度、酶活力和特异性均达到分子生物学实验的要求 ,各项指标优于市售商品酶     

新疆南疆地区奶牛乳房链球菌gapC基因原核表达载体的构建

为获得乳房链球菌(Streptococcus uberis)gapC基因的原核表达载体,通过PCR方法扩增出新疆南疆地区奶牛乳房链球菌临床分离株的gapC基因,并克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a(+)-gapC,将重组质粒转化宿主菌E.coli BL21进行重组蛋白的表达。实验结果表明,IPTG诱导5～9 h均可获得大量重组蛋白。重组蛋白分子量约为54.0 kD,介于43 kD～66.2 kD之间,与预期大小一致,说明表达载体构建成功。通过优化最佳诱导条件,获得乳房链球菌gapC基因重组蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L IPTG诱导6 h即可获得大量重组蛋白,为进一步确定蛋白的免疫保护性和制备疫苗奠定了基础。     

欧李ChPSY基因的原核表达

为了解欧李果实类胡萝卜素合成过程中八氢番茄红素合成酶基因的作用和功能,将从欧李成熟果实中分离的ChPSY cDNA序列,连接到原核表达载体pET-28a(+),导入大肠杆菌BL21(DE3)体内诱导表达。SDS-PAGE分析表明,1.0 mmol/LIPTG诱导4 h,表达了相对分子量约为45.8 kD融合蛋白产物;IPTG的浓度和诱导时间优化表明,1.2 mmol/LIPTG诱导6 h时,融合蛋白的表达量最大。此外,Western-blot试验证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。这为欧李八氢番茄红素合成酶基因ChPSY生物学功能的深入研究奠定了基础。     

不同诱导培养条件对重组绵羊β2-AR第二细胞外环在大肠杆菌中表达的影响

[目的和方法]研究对不同诱导时间、诱导剂IPTG终浓度、培养温度和振荡培养箱转速等4个诱导培养条件对绵羊β_2-肾上腺素能受体(β_2-adrenoceptor,β_2-AR)第二细胞外环重组质粒pET32C-AR/Se在大肠杆菌BL21(DE3)中表达水平的影响进行了研究,以筛选其最佳培养条件.[结果]随着IPTG诱导时间的延长,重组绵羊β2-AR第二细胞外环的相对表达量逐渐增加,在2 h时相对表达量达到最大值,为菌体总蛋白的30.1;.IPTG终浓度在0.01～2 mmol/L时,重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量水平均在27;～30;;当IPTG终浓度为0.01 mmol/L时,重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量最高,占菌体总蛋白的30.5 ;.在设置的4个诱导温度中,25℃时重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量最高,占菌体总蛋白的35.5;.在振荡培养箱不同转速条件下,重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量在33;～40;波动;在200 r/min时,相对表达水平最高,为细菌总蛋白的40.0;.[结论]绵羊β_2-AR第二细胞外环基因在大肠杆菌中的表达最佳条件为:重组菌株在LB液体培养基中生长至OD_(600) 0.5左右时,加入IPTG至终浓度0.01 mmol/L,于25℃、200 r/min诱导120 min.     

稻瘟病菌MGG-01005的表达纯化与生物信息学分析

MGG-01005是与稻瘟病菌的菌丝生长有重要关系的基因,对其进行一般理化性质、结构域、功能位点预测等一系列生物信息学分析,构建了原核表达载体pETM13-MGG-01005,利用IPTG诱导重组蛋白表达,并通过镍离子亲和层析、阴离子交换层析以及分子筛层析进行蛋白纯化。结果显示,该蛋白相对分子质量约为16 471.49 u,编码153个氨基酸,含Tctex-1结构域,无跨膜结构和信号肽,无功能位点,存在磷酸活性位点,为不稳定亲水蛋白;该蛋白可被0.1 mmol·L ^-1 IPTG诱导表达,亲和层析的最适洗脱液组分为20 mmol·L ^-1 Tris-HCl,500 mmol·L ^-1 NaCl,80 mmol·L ^-1咪唑;阴离子交换层析表明该蛋白对低盐条件具耐受性;分子筛层析具有形态均一且对称性良好的构象,最大洗脱峰出峰位置对应的蛋白相对分子质量约为35 ku,表明该蛋白以二聚体形式存在。本研究最终得到大量高纯蛋白,以期为进一步探索该蛋白的功能以及稻瘟病菌的后续相关研究奠定理论与实践基础。     

Expression of Duck Interferon Alpha in BL21（DE3）plysS

To obtain the protein of duck interferon alpha and study its biological activities, the prokaryotic ex-pression vector of DuIFN-α was constructed and expressed in BL21 (DE3) plysS. Using PCR technique, the proteingene of DuIFN-α was cloned from pMD-18-duIFN-α recombinant. The gene was then inserted to pGEM-T vectorand identified by restriction endonuclease analysis and sequencing. DuIFN-α was ligated with the prokaryotic expres-sion vector of pET30 a, then transformed into BL21 (DE3) plysS. The best inducing time and IPTG concentration for the expression of this recombinant protein was tested through the expression of the positive recombinant with differ-ent time span and different IPTG concentration. Lots of the protein of DuIFN-α were expressed in BL21 (DE3)plysS with 1 mmol·L-1 IPTG for 4 hours and its molecular weight for 34 000.     

纳豆激酶基因的克隆和高效表达

为了克隆纳豆激酶(Nattokinase,NK)基因,实现纳豆激酶在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究,首先以从枯草芽孢杆菌中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增包括信号肽、前导肽、成熟肽序列的前纳豆激酶原基因,将其克隆到载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-NK,成功转化大肠杆菌BL21(DE3);然后优化影响该基因表达的温度、时间和IPTG添加量等因素。结果表明,重组菌株BL21(DE3)-NK在20℃下培养、IPTG添加量为0.4 mmol·L-1、培养20 h时表达产物的纤溶活性最大,可达到81.73 U·mL-1,SDS-PAGE检测观察到1条38 kDa的蛋白条带,与预期相符。