斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h与小分子化合物的结合特征

【目的】克隆斑翅果蝇（Drosophila suzukii）气味结合蛋白56h（odorant binding protein 56h,OBP56h）基因,诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h),研究其与小分子化合物的结合特性。【方法】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇OBP56h ORF全长,从NCBI数据库中下载相似度高的昆虫气味结合蛋白序列,进行序列比对和分析。以NdeⅠ和XhoⅠ为酶切位点,将OBP56h连入pET-30a(+)原核表达载体,将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。扩大培养阳性菌株,并用IPTG诱导表达DsuzOBP56h重组蛋白。收集菌液,通过超声波破碎细胞得到蛋白,利用Ni-NTA柱纯化蛋白,进行Tris-HCl透析,用BCA法测定蛋白浓度。蛋白用50 mmol·L ^-1 Tris-HCl（pH 7.4）稀释至终浓度2 μmol·L ^-1,配基用色谱级甲醇稀释至终浓度1 mmol·L ^-1,以4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5′-二磺酸二钾盐（4,4′-dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonic acid dipotassium salt,bis-ANS）荧光探针为报告子,利用荧光竞争结合试验检测DsuzOBP56h蛋白与18种候选小分子化合物配基的结合特性。 【结果】克隆获得了斑翅果蝇OBP56h的ORF全长,共405 bp,N-端含有19个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守半胱氨酸位点,符合OBP的典型特征,与其同属的黑腹果蝇OBP56h进化关系最近。成功连入pET-30a(+)表达载体,在1 mmol·L ^-1IPTG、28℃条件下诱导DsuzOBP56h蛋白表达,并过柱纯化得到目的蛋白。荧光光谱试验显示,荧光探针bis-ANS与DsuzOBP56h的解离常数为0.9568 μmol·L ^-1,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子;进一步的荧光竞争结合试验表明,在18种候选配基中,苦味物质盐酸小蘖碱和香豆素与DsuzOBP56h的结合亲和性较强,解离常数分别为12.16和17.93 μmol·L ^-1,柚皮素与DsuzOBP56h的解离常数为25.32 μmol·L ^-1,草莓叶片产生的一种对斑翅果蝇具有吸引作用的挥发性气味物质β-环柠檬醛也能与DsuzOBP56h结合,其解离常数为31.37 μmol·L ^-1。【结论】斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h能与测试的多种植物苦味物质和挥发性气味物质结合,表明DsuzOBP56h很有可能参与斑翅果蝇对食物味觉和嗅觉的识别行为,研究结果可为理解斑翅果蝇的取食行为提供理论依据,并为开展斑翅果蝇的生态防控提供新思路。     

睾丸酮丛毛单胞菌ATCC 11996类固醇脱氢酶3α-HSD的高效表达与纯化

利用分子克隆的方法扩增与克隆睾丸酮丛毛单胞菌ATCC 11996的3α-HSD基因,构建以pET-15b为载体的表达工程菌,IPTG诱导蛋白表达,通过优化表达菌的最佳表达条件得到最大表达量的目的蛋白.诱导后将工程菌裂解,通过硫酸铵沉淀,Ni-NTA亲和层析,分子筛分离进行纯化,并测定纯化后蛋白的酶活性.结果表明:1)克隆获得了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因并实现了异源表达;2)工程菌的最佳表达条件为:37℃培养,0.6mmol/L IPTG诱导4h,培养基中Zn2+终浓度为0.1 mmol/L;3)表达工程菌裂解后用60％硫酸铵沉淀,亲和层析和分子筛分离后得到了纯度高达99％的目的蛋白,纯化后的蛋白保持酶活性.本试验成功克隆表达了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因,建立了3α-HSD的高效表达与纯化方法,为相应抗体的制备与水资源中的类固醇激素检测方法的建立提供基础.     

与DNA硫修饰相关的DndB 蛋白纯化体系的建立

根据DndB蛋白表达载体的特性,建立了一套集Ni2+-NTA亲和层析、Source Q阴离子交换层析和Superdex 200分子筛层析于一体的纯化体系,纯化得到高纯度的DndB蛋白,可用于后续的蛋白质结构生物学和酶学特性研究,为阐明DndB蛋白的功能以及DNA硫修饰的机理打下了良好的基础.     

稻瘟病抗性基因Pi36原核表达载体构建·表达与鉴定

[目的]研究稻瘟病抗性基因Pi36的结构和功能。[方法]利用双酶切构建Pi36基因CC、NBS结构域的原核表达载体,通过菌落PCR鉴定和测序验证阳性克隆。然后分别收集不同浓度IPTG诱导,不同温度30和37℃分别培养的大肠杆菌细胞提取蛋白,利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。[结果]当IPTG浓度为1mmol/L、30℃培养3h,目的蛋白表达量最大。[结论]为进一步研究稻瘟病抗性基因Pi36的抗病机理奠定基础。     

GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞自噬与凋亡的影响

【目的】细胞自噬和凋亡存在着相互制约,p38MAPK信号通路作为细胞凋亡的主要调控通路之一,也对细胞自噬存在促进和抑制的双重作用。已有研究表明,促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone , GnIH)对细胞自噬与凋亡均有影响,但作用机制尚不明确。故探究GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞（pGCs）自噬与凋亡的影响及其机理,为解决母猪的产子率以及同期发情等问题提供参考。【方法】min、10 min、30 min、60 min、90 min)分组,用Western blot检测猪卵巢颗粒细胞p38与p-p38的蛋白表达量变化;2、验证GnIH对p38MAPK信号通路的影响：按（空白对照、GnIH、p38激活剂（U-46619）、U-46619+GnIH）分组,用Western blot检测p38与p-p38的蛋白表达量变化;3、探究不同浓度GnIH对自噬和凋亡的影响：按（空白对照、10 ^-6mol·L ^-1 GnIH、10 ^-8mol·L ^-1 GnIH、10 ^-10mol·L ^-1 GnIH、10 ^-12mol·L ^-1 GnIH）分组,用Western blot检测自噬与凋亡标志性蛋白的表达量变化;4、验证不同浓度GnIH通过p38信号通路对自噬和凋亡的影响：将细胞分成6组（空白对照、U-46619、U-46619+10 ^-6 mol·L ^-1 GnIH、U-46619+10 ^-8mol·L ^-1 GnIH、U-46619+10 ^-10mol·L ^-1 GnIH、U-46619+10 ^-12mol·L ^-1 GnIH）,用Western blot检测自噬与凋亡标志性蛋白的表达量变化。【结果】1. GnIH孵育10 min后,显著降低p38与p-p38的蛋白表达量（P<0.05）,提示,GnIH对p38MAPK信号通路的最佳作用时间为10 min;2. U-46619显著促进pGCs的p38磷酸化水平（P<0.05）,GnIH显著抑制pGCs的p38磷酸化水平（P<0.05）,提示,U-46619使p38MAPK信号通路活化,GnIH对p38MAPK信号通路的活化有抑制作用;3. 当 GnIH的浓度为10 ^-6 mol·L ^-1时,pGCs的自噬和凋亡水平显著升高（P<0.05）,随着GnIH浓度的降低,pGCs的自噬水平逐渐升高（P<0.05）,pGCs的凋亡水平逐渐降低（P<0.05）,提示,高浓度GnIH可以促进自噬和凋亡,随着GnIH浓度的降低,自噬水平逐渐升高,而凋亡水平逐渐下降;4. 加入U-46619后,GnIH使pGCs的自噬显著上调（P<0.05）,并且使pGCs的凋亡显著下调（P<0.05）,提示,不同浓度GnIH通过p38MAPK信号通路影响pGCs的自噬和凋亡。【结论】GnIH可能通过抑制p38MAPK信号通路的活化,上调pGCs的自噬,减少pGCs的凋亡。     

硒对S. aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响

【目的】硒（Se）能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染的奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以10 ⁶细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8 μmol·L ^-1浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照（Con）组（bMECs）、模型（Mod）组（bMECs+S. aureus）和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组（bMECs+2 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）、Mid组（bMECs+4 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）和Hig组（bMECs+8 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）,每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20 μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的 Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。 【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.01）。S. aureus感染0.5 h后,Nod2蛋白水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加2 μmol·L ^-1 的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒可显著抑制Nod2的表达（P<0.05）; S . aureus感染0.5 h后,RIP2蛋白水平显著升高（P<0.05）,而在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制RIP2蛋白的表达（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.05）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）; S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里分别添加4 μmol·L ^-1 和8 μmol·L ^-1 硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.05）。 【结论】硒可通过抑制bMECs Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键因子蛋白的表达而减轻S. aureus诱导的bMECs炎症反应。     

猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立

依据GenBank已发表的猪干扰素α1(poIFN-α1)成熟肽基因序列,胸腺肽α1(THY-α1)蛋白序列及Escherichia coliB密码子使用频率表,优化并人工合成poIFN-α1和THY-α1基因,利用SOE-PCR法在poIFN-α1和THY-α1之间设计1个13肽Linker。将融合基因克隆至pRSFDue-t 1表达载体,转化BL21(DE3)感受态,37℃培养至菌液OD600为0.6~0.8,IPTG(0.5 mmol/L)诱导,20℃培养12h,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明:目的蛋白为菌体内可溶性表达,经强阴离子交换层析和疏水层析纯化获得高纯度poIFNα1-THYα1融合蛋白。     

14-3-3蛋程中的互作靶蛋白鉴定及其对外源激素的响应

【目的】籽粒灌浆对水稻产量及品质的形成至关重要。14-3-3蛋白是一种信号转导调节因子,在植物生长发育中发挥着重要调控作用。本研究通过分析14-3-3蛋白家族在籽粒灌浆过程中的基因表达模式及其互作靶蛋白,从而揭示其在籽粒灌浆过程中的功能。【方法】利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析水稻14-3-3基因家族在籽粒灌浆过程中的表达变化模式,并从中选取GF14b及GF14e进行后续的蛋白功能分析。利用KEGG数据库对GF14b及GF14e蛋白功能motif位点进行分析;构建GST-GF14b及GST-GF14e表达载体,利用亲和层析技术分别钓取籽粒中与GF14b及GF14e互作的靶蛋白,并借助LC-MS/MS对靶蛋白进行鉴定。采用GST pull-down方法验证靶蛋白与GF14b及GF14e间的蛋白互作关系。利用Kinasephos在线程序对靶蛋白的Ser和Thr磷酸化位点进行预测;采用MapMan 3.6.0软件对靶蛋白的功能及参与的代谢过程进行分析。在籽粒灌浆期（花后15 d）,分别喷施25×10^-6mol·L^-1 ABA,10×10^-6mol·L^-1 IAA,100×10^-6mol·L^-1 GA,50×10^-6mol·L^-1 ZR和 2×10^-4mol·L^-1 BR,研究外源激素处理对籽粒灌浆过程中GF14b,GF14e及其互作靶基因表达的影响。【结果】14-3-3家族基因中,除GF14h外,其余7个家族成员在水稻籽粒中均有表达,其中GF14b及GF14e在籽粒灌浆过程中的表达水平较高且变化幅度较大。通过蛋白序列分析发现,GF14b与GF14e间具有3个相同,2个差异的motif功能位点。通过亲和层析试验,在籽粒中共鉴定到59个与GF14b和72个与GF14e互作的靶蛋白,其中有43个靶蛋白与2个成员均有互作,分别有16个和29个靶蛋白与GF14b和GF14e特异结合。随机选取2个靶蛋白进行体外蛋白互作验证,结果表明靶蛋白SUS3与GF14b和GF14e均存在互作关系,而靶蛋白PSA仅与GF14e有相互作用关系,验证了亲和层析结果的准确性。蛋白功能的分析表明,GF14b和GF14e通过与靶蛋白的结合,共同参与了籽粒灌浆过程中蔗糖转化、淀粉合成、糖酵解、TCA循环等碳代谢途径。同时,GF14b及GF14e还具有特异的调控功能,其中GF14b与核酸代谢及物质转运密切相关,而GF14e与C1代谢中的关键蛋白存在互作。此外,大部分靶蛋白均鉴定到具有潜在的Ser和Thr磷酸化位点。外源激素处理下,籽粒中GF14b和GF14e上调表达,而与淀粉合成代谢相关的靶基因（SUS2、 AGPS、AGPL、PPDK2、SBE）大部分呈下调表达的趋势。【结论】14-3-3基因家族成员GF14b和GF14e在水稻籽粒灌浆过程中的表达变化幅度较大,且会响应激素浓度的改变,并通过蛋白互作的形式负调控淀粉合成代谢相关基因的表达,从而对水稻籽粒淀粉的合成起到重要的调控作用。     

9种杀菌剂对新疆荒漠绿洲稻区水稻稻瘟病的防治效果评价

【目的】筛选防治稻瘟病的田间药剂,为新疆水稻稻瘟病的科学防治提供指导。【方法】采用随机区组的方法,定点调查各处理稻瘟病发生情况,评价供试药剂对稻瘟病的防治效果。【结果】药后14 d,75%三环唑WP 225 g a. i/hm²处理和325 g/L苯甲·嘧菌酯SC 243.75 g a. i/hm²处理对水稻稻瘟病的防效最高,分别为72.63%和71.77%;其次是2%春雷霉素SL 30 g a. i/hm²处理和500 g/L甲基硫菌灵SC 1 125 g a. i/hm²处理,对水稻稻瘟病防效分别为61.48%和61.27%。各药剂处理对水稻生长发育无异常影响、无药害。【结论】75%三环唑WP 225 g a. i/hm²处理、325 g/L苯甲·嘧菌酯SC 243.75 g a. i/hm²处理、2%春雷霉素SL 30 g a.i/hm²处理和500 g/L甲基硫菌灵SC 1 125 g a. i/hm²处理,可有效控制水稻稻瘟病的发生与危害,且对水稻生长安全,可在大田合理轮换使用。     

谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35在水稻中对盐胁迫的响应

【目的】盐胁迫影响作物的产量和品质,而作物的耐盐性受特定基因的调控。在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35过表达水稻株系的基础上,拟结合植株在盐胁迫下的表型,对部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。【方法】 选取谷子SiRLK35过表达水稻株系,分别为过表达株系（over-expression,OE）-1（OE-1）、OE-2和OE-3,以野生型中花11为对照,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测各株系中SiRLK35的表达情况;分别用含0、150和200 mmol·L ^-1 NaCl的MS培养液处理三叶期的对照及转基因株系幼苗,观察其表型,统计150 mmol·L ^-1 NaCl处理3 d后苗长及根长;用150 mmol·L ^-1 NaCl处理四叶期幼苗,统计处理14 d后材料干重、死亡率和死叶率,对各材料的耐盐性进行评价;进一步挑选SiRLK35过表达程度高且耐盐表型好的OE-1株系,利用3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑（nitrotetrazolium blue chloride,NBT）染色检测其胁迫下过氧化物积累及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化物酶（peroxidase,POD）的活性;并对部分盐害响应基因的表达模式进行检测。 【结果】 谷子SiRLK35在株系OE-1中的相对表达量最高;150 mmol·L ^-1NaCl处理3 d幼苗后,中花11苗长和根长的生长受抑制程度均大于SiRLK35过表达株系,其中OE-1的受抑制程度最小;四叶期幼苗经150 mmol·L ^-1 NaCl处理14 d后,转基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于对照,且幼苗死亡率和死叶率均低于对照;盐胁迫下对照过氧化染色反应明显,O ^2-和H₂O₂的积累均高于过表达植株,SOD和POD抗氧化酶活性均高于对照;部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍。 【结论】 谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性,SiRLK35可通过调控抗氧化酶活性及相关信号途径,从而参与盐害响应。     

鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16 ℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-ChPrnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。     

青枯菌铜抗性基因copA 的功能

【目的】 植物细菌性青枯病（bacterial wilt of plants）是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum ）引起的一种世界性重大土传病害。作为防治青枯病等细菌性病害的重要杀菌剂,铜制剂的广泛使用造成多种植物病原细菌群体中出现了铜抗性菌株。青枯菌Po82菌株大质粒上携带了丁香假单胞菌中的铜抗性编码基因copA 的同源物,论文旨在探明青枯菌Po82菌株copA 在铜抗性、致病性等方面的生物学功能。【方法】 以青枯菌Po82菌株为研究对象,利用MEGA6.0软件包,基于邻接法构建copA 的系统发育树,探究铜抗性基因copA 在青枯菌和其他植物病原细菌中的系统进化关系。通过反向遗传学的研究手段,采用基因同源重组双交换和电击转化法,构建copA 基因缺失菌株及相应互补菌株。通过最小抑制浓度（minimal inhibition concentration,MIC）测定、RT-qPCR、Biolog代谢芯片以及致病力等基础生物学测定研究手段,解析copA 与青枯菌铜胁迫应答、代谢活性、致病性和运动性等表型生物学特征之间的关系。【结果】 同源性比对分析结果显示,copA 广泛存在于青枯菌群体中,青枯菌copA 在亲缘关系上与耐金属贪铜菌最为紧密, 与稻黄单胞菌、丁香假单胞菌和大肠杆菌的亲缘关系较远。RT-qPCR结果显示copA 的表达受到铜离子的诱导,copA 的表达量随着CuSO₄浓度的增加而增加。CuSO₄浓度为1.0 mmol·L ^-1时,基因表达量最高。铜MIC测定结果显示copA 基因缺失菌株对铜离子的敏感性增加,copA 基因缺失菌株的MIC值为0.8 mmol·L ^-1,较野生型菌株的1.2 mmol·L ^-1下降了33.3%,互补菌株恢复了铜抗性能力,表明copA 在青枯菌的铜胁迫应答过程中发挥着重要作用。与野生型菌株相比,copA 基因缺失菌株在普通NA培养基及含0.6 mmol·L ^-1 CuSO₄的NA培养基中的对数生长期的生长速率降低,表明copA 与青枯菌的生长速率相关。copA 基因缺失菌株于发病前期病情指数较野生型菌株下降,接种第10天,copA 基因缺失菌株的病情指数较Po82野生型菌株下降了11.7%。copA 的缺失导致青枯菌对α -D-葡萄糖和D-海藻糖等碳源,L-丙氨酸和葡萄糖醛酰胺等氮源的代谢利用速率降低,使青枯病发病病程延长。与野生型菌株Po82相比,copA 基因缺失菌株中III型分泌系统的转录激活因子编码基因hrpG 和hrpB ,III型效应子RipX编码基因ripX 的表达量显著下调。 【结论】 铜抗性基因copA 在青枯菌铜胁迫应答、致病性等方面发挥一定的作用,研究结果可为进一步解析青枯菌的铜抗性分子机制以及铜抗性菌株的防治提供理论依据。     

陆地棉盐胁迫应答基因GhPEAMT1的克隆及功能分析

【目的】磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（phosphoethanolamine N-methyltransferse,PEAMT）是植物磷酸胆碱合成的关键酶,而磷酸胆碱是可以增强植物抗性的甘氨酸甜菜碱合成底物胆碱的前体。通过对陆地棉磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（GhPEAMT1）的克隆、表达模式分析,以及功能验证,探究GhPEAMT1在陆地棉响应盐胁迫中的生物学功能,为棉花耐盐品种的选育提供基因资源。【方法】根据转录组测序数据分析,最终确定GhPEAMT1为耐盐候选基因;通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因;通过生物信息学分析基因结构特征、预测蛋白质相对分子质量以及进化关系;利用荧光定量PCR（qRT-PCR）分析耐盐棉花品种早熟长绒7号和感盐棉花品种南丹巴地大花在NaCl胁迫后不同时间点不同组织的表达特征;构建亚细胞定位载体,进行烟草的瞬时转化,确定蛋白质在细胞中的位置;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,分析转基因拟南芥种子在盐胁迫下的萌发率和转基因拟南芥主根长度;利用病毒诱导基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）对早熟长绒7号棉花品种进行目的基因沉默,提取棉花叶片的RNA进行实时荧光定量用以检测基因沉默效率,随后用40 g·L^-1的NaCl溶液的处理对照棉花植株（CK）、注射TRV2:00的棉花植株、GhPEAMT1A和GhPEAMT1D沉默成功的棉花植株,测定棉花叶片过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）的活性。【结果】克隆获得GhPEAMT1的2个同源基因GhPEAMT1A和GhPEAMT1D,2个基因的CDS全长分别为1 488和1 485 bp;构建进化树发现,GhPEAMT1与海岛棉同源基因的亲缘关系最近,而与其他物种相比,与可可同源性最高;盐胁迫条件下,GhPEAMT1A和GhPEAMT1D在耐盐品种早熟长绒7号叶片和根中的表达量显著高于感盐品种南丹巴地大花。亚细胞定位显示该基因位于细胞质中;超表达转基因拟南芥后,在100和150 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基上,转基因拟南芥的种子萌发率显著高于野生型拟南芥。在50和100 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基上,转基因拟南芥的主根长极显著高于野生型拟南芥的主根长;用40 g·L^-1的NaCl溶液处理24 h后,GhPEAMT1A和GhPEAMT1D沉默成功的棉花植株叶片比CK和注射TRV2:00的棉花植株的棉花叶片萎蔫严重,盐胁迫后,与注射空载棉花植株相比,注射TRV2::GhPEAMT1A棉花植株过氧化氢酶（CAT）活性降低、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性降低。【结论】GhPEAMT1可以增强拟南芥对盐胁迫的耐性,GhPEAMT1能够响应盐胁迫并起正向调控作用。     

沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、 原核表达及其结合特性

【目的】 沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】 基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】 GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp（GenBank登录号MK250532）,其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框（ORF）全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8 μmol·L ^-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55 μmol·L ^-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29 μmol·L ^-1。【结论】 沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。     

根际盐分差异性分布对高粱幼苗生长发育的影响

【目的】盐碱地盐分含量在土壤表层的分布通常是不均匀的,研究不均匀盐胁迫条件下高粱幼苗生长发育和生理生化指标的变化,可为盐碱地高粱栽培和盐碱地高效开发利用提供理论依据。【方法】 利用分根法将高粱根系均匀分成2部分,并分别置于不同浓度（mmol·L ^-1）NaCl中,设置对照为无盐胁迫（记作0/0,下同）、不均匀盐处理（0/200、50/150）和均匀盐处理（100/100）,在人工气候室培养14 d后取样,测量生物量、叶面积、SPAD值、根系形态、渗透调节物质、抗氧化酶活性和光合参数等性状,研究分根盐胁迫条件下高粱生长发育的变化规律。 【结果】 不均匀盐胁迫和均匀盐胁迫均严重影响了高粱幼苗的生长发育,显著降低了高粱幼苗鲜重、干重和叶面积,对叶片的光合能力、抗氧化酶活性和渗透调节物质均有一定程度的影响。然而,不均匀盐处理50/150和0/200的单株干重比均匀盐处理提高了21.19%和62.71%,单株鲜重提高了35.39%和86.44%,叶面积提高了13.22%和88.66%;50/150处理低盐一侧根系鲜重和干重分别是高盐一侧的1.90倍和2.10倍,0/200处理无盐一侧根系鲜重和干重分别是盐胁迫一侧的3.02倍和3.75倍。同样,不均匀盐处理对局部根系形态影响显著,低盐或无盐一侧根系生长明显增加,50/150和0/200处理低盐一侧的根系长度、根系体积、根尖数和分支数显著高于高盐或有盐胁迫一侧根系,进而不均匀盐胁迫条件下整个根系的根系长度、根系体积、根尖数和分支数都高于均匀盐胁迫处理,其中0/200处理的各项指标与均匀盐处理差异均达到显著性水平（P<0.05）。叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性在不均匀盐胁迫条件下显著升高（P<0.05）;不均匀盐处理的叶片渗透调节性物质脯氨酸（PRO）和可溶性糖（SS）含量显著高于均匀盐处理,丙二醛（MDA）含量显著下降（P<0.05）。不均匀盐处理条件下植株光合能力相对于均匀盐处理也得到显著改善,主要体现在显著升高的光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）;相较于均匀盐处理,在不均匀盐处理条件下50/150、0/200的荧光参数实际光化学效率（ΦPSⅡ）、最大光化学效率（Fv/Fm）和电子传递效率（ETR）分别提高了5.64%和19.00%、9.25%和18.89%、1.93%和6.89%,其中0/200处理的ΦPSⅡ和Fv/Fm与100/100处理的差异达到显著性水平（P<0.05）。【结论】 不均匀盐处理和均匀盐处理对高粱幼苗生长均产生抑制,但在不均匀盐胁迫条件下,由于低盐或无盐一侧根系补偿性增长,整个根系形态得到改善,叶片抗氧化酶活性、渗透调节能力和光合能力均有一定程度提高,因而缓解盐胁迫对高粱幼苗的危害。     

肉用绵羊生长期甲烷排放特点与预测模型的建立

【目的】通过探索生长期肉用绵羊的甲烷（CH₄）排放规律,旨在建立相关的CH₄预测模型。【方法】采用单因素试验设计,以饲粮NFC/NDF（非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维）为0.78自由采食组的平均日增重作为饲粮NFC/NDF为1.03组和2.17组的限饲标准,在此基础下测定肉用绵羊的生长性能、营养物质消化率和甲烷产量,并分析肉用绵羊不同体重阶段的甲烷产量与饲粮干物质基础下的营养物质含量、营养物质摄入量、可消化营养物质摄入量及营养物质消化率间的回归关系。【结果】预测肉用绵羊生长早期（25—35 kg）CH₄产量的最佳一元和多元回归模型分别为：CH₄（L·d ^-1）= -26.58×NFC/NDF + 92.7（R ² = 0.772,P <0.001）;CH₄ (L·d ^-1)=2.71×NDFD-2.45×DMD-0.97 CPD+124.46（R ²=0.846,P=0.001）。预测肉用绵羊生长后期（48-55 kg）CH₄产量的最佳一元和多元回归模型分别为：CH₄ (L/d)=-57.00×GE (MJ·kg ^-1)+1076.0（R ²=0.581,P=0.002）;CH₄/BW ^0.75(L/kg ^0.75)=-0.013×NDF intake (g/d)-0.13×CP intake (g/d)+0.02×DM intake (g/d)+0.84（R ²=0.652,P=0.019）。而肉用绵羊生长期整体CH₄产量的最佳一元和多元预测模型分别为：CH₄(L/d)=-26.94×NFC/NDF+90.71（R ²=0.655,P <0.001）;CH₄/BW ^0.75(L/kg ^0.75)=0.005×Digestible NDF intake (g·d ^-1)+0.011×Digestible DM intake (g·d ^-1) - 0.097×Digestible CP intake (g·d ^-1)-4.78 （R ²=0.722,P <0.001）。 【结论】建立了肉用绵羊独立生长阶段（25—35 kg、48—55 kg）和整体生长阶段（25—55 kg）的CH₄预测模型。研究表明,处于不同体重阶段的肉用绵羊的最佳甲烷预测因子不尽相同,且甲烷产量受饲粮NFC/NDF影响较大。这可为今后评估我国饲养模式下的甲烷产量提供理论依据,也可为肉用绵羊饲粮的合理配制提供技术参考。