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农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入桑树的研究 总被引:23,自引:5,他引:18
人工合成柞蚕抗菌肽D基因通过根癌农杆菌Ti质粒载体转入桑树叶盘,获得基因转化工程苗。柞蚕抗菌肽对桑树青枯病假单孢菌有明显杀菌作用。人工合成柞蚕抗菌肽基因导入农杆菌感染桑树叶盘并诱导成苗。经卡那霉素筛选,胭脂碱电泳检测及抗菌肽基因探针进行印迹点杂交,确认抗菌肽基因转化桑苗成功,为培育抗青枯病品种打下基础。 相似文献
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人工合成Cecropin AD基因在酵母中表达 总被引:6,自引:2,他引:4
Cecropin AD 是由Cecropin A的N 端1 11 位氨基酸残基和Cecropin D 的C 端12 37 位氨基酸残基构成的一个杂合肽,抗菌活性高于天然抗菌肽。根据Cecropin AD 的氨基酸序列,以酵母偏爱密码设计了Cecropin AD 基因,全长140bp 。采用基因片段化学合成结合PCR 法合成Cecropin AD 基因。合成的Cecropin AD 基因克隆到pCRTM21 上,进行DNA 序列测定,证实合成的Cecropin AD 基因的DNA 序列与设计序列完全一致。将Cecropin 基因定向克隆到大肠杆菌 酵母穿梭质粒pCLWA2 的Bam HI和Sal Ⅰ位点上,构建成含Cecropin 基因的重组质粒pCAD,将重组质粒转化入宿主酵母AB103 ,以大肠杆菌K12D31 为指示菌,用活性蛋白酸性PAGE 法测定,具有抑菌活性,表明Cecropin 基因在酵母中获得表达。 相似文献
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以PstI酶切含禽多杀性巴氏杆菌保护性荚膜抗原基因片段PCA10的重组质粒rPCA10,收集基因片段PCA10,经修饰后依次连接到系列高效表达载体PEV—Vrf1~3的BamHI切点上,转化至E.coliRRI(pRK248cIts)中。经快速检测,这3种载体的重组子中均有PCA10插入。以间接ELIsA检测重组子转化菌,只有PEV—Vr13载体的重组子转化菌与禽巴氏杆菌保护性荚膜抗原(PCA)抗血清呈阳性反应,且OD值为原克隆菌株rPCA10的3倍,初步证明PC10已克隆至高效表达载体PEV—Vrf3上,而且读码框架正确。用ELIsA阳性表达克隆株PcA71—Vrf3免疫小鼠和鸡,均达到70%的保护率。 相似文献
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大肠杆菌不耐热性肠毒素LT_B基因的克隆及其核苷酸序列分析 总被引:12,自引:0,他引:12
用内切酶SacⅠ和HindⅢ双酶切大肠杆菌质粒pEWD299,回收505bp的LTB基因片段,再将载体pUC18用SacⅠ和HindⅢ双酶切,最后将pUC18DNA与505bp的LTBDNA进行连接,转化至受体菌DH5α中,经SacⅠ/HindⅢ、EcoRⅠ/HindⅢ酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子质粒pXLT1。再将pXLT1进行EcoRⅠ酶切、大肠杆菌聚合酶ⅠKlenow大片段补平、HindⅢ酶切处理,然后与用HicⅡ和HindⅢ酶切的pUC18连接,转化至受体菌DH5α中,经XbaⅠ/HindⅢ酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子质粒pXLT1-1。将质粒pXLT1-1进行核苷酸序列分析,确定了插入的LTB基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列 相似文献
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大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的构建 总被引:13,自引:0,他引:13
用BamHI和HindⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)基因的质粒pXLT1-1,回收505bp的LTB基因片段,再用BamHI和HindⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素(ST1)基因的质粒pXST1,与上述回收的LTB基因片段连接,转化至受体菌JM109中。经EcoRI、BamHI、HindⅢ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组子质粒pXSLT1。ELISA检测到了ST1-LTB融合蛋白,而且该融合蛋白无天然ST1生物毒性。 相似文献
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柞蚕抗力肽D转基因酵母的培养及表达产物的分析 总被引:1,自引:0,他引:1
采用碱金属法(醋酸锂盐),以大肠杆菌-酵母穿梭质粒表达载体在酵母中表达人工合成的柞蚕抗菌肽D基因。用电泳及抗菌肽活性检测法对表达产物进行分析。同时研究了转基因酵母的发酵条件,如温度,pH及营养等对酵母表达的影响。试验结果表明转基因酵母表达产物为1.14mg/L培养液,杀菌活力为0.216单位。 相似文献
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狂犬病病毒糖蛋白基因在原核细胞中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
将狂犬病病毒糖蛋白(RVgp)基因BglⅡ片段(1675bp)分别正向插入到原核高效表达载体pET-17b和pET-17b2(用SacⅠ-NdeⅠ缺失掉pET-17b60bp含起始密码子ATG小片段)的BamHⅠ切点,构建重组质粒pET-17bRVgp和pET-17b2RVgp。将其分别转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)和E,coliBL21(DE3)plysS.IPTG诱导表达,菌体经超声波裂解处理后SDS-pAGE,染色,在分子量约60000处可见重组质粒表达的较宽的蛋白带,以抗RVgpMcAb进行Western-blot检测,表明该表达蛋白为RVgp。通过扫描显示,表达的RVgp占菌体总蛋白的10%~14%,其中pET-17b2RVgp在E。coliBL21(DE3)中的表达量最高。 相似文献
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腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊白细胞介素-2融合基因表达载体的构建及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
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构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达 总被引:1,自引:1,他引:0
将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因. 相似文献
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应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒(PRV)Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段,将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明,糖蛋白gD基因去信号肽片段长1155bp,与PRVFa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol/L IPTG诱导后,重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏 菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5a中均得到表达,其中在宿主菌XL 1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示,大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。 相似文献
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前期采用差减杂交的方法筛选到新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin,其基因全长为477 bp,编码159个氨基酸,理论分子量约17.4 kDa。为了获得具活性的大量表达的抗菌肽,本研究利用毕赤酵母表达了elecilin。首先将elecilin基因克隆至酵母分泌表达载体pPICZaA,构建了重组分泌表达质粒pPICZaA-elecilin,电击转化毕赤酵母X-33。经Zeocin筛选和PCR鉴定,获得重组酵母菌,通过甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定,证实诱导后的培养基中存在与预期分子量大小相一致的蛋白,能被His-tag单克隆抗体识别,表明利用酵母成功表达了欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin。这为进一步研究该抗菌肽的功能及作为饲料添加剂的应用奠定了基础。 相似文献
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为进一步研究MHCⅠ类分子作用机制,以及为制备MHCⅠ基因工程疫苗奠定基础,克隆鸡MHCⅠ基因,并构建MHCⅠβ2m-α融合基因进行原核表达。运用RT-PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m链基因,并通过编码连接肽(Gly4Ser)4的基因序列将两者头尾相连,构建了pET-32a-MHCⅠβ2m-α重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组质粒在E.coli BL21细胞进行IPTG诱导表达融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法分别检测表达产物。结果表明,成功克隆了MHCⅠα和β2m链基因,长度分别为1014和300 bp;构建的融合基因MHCⅠβ2m-α长度为1194 bp,经原核表达,融合蛋白分子质量约为62.0 ku,能与相应的抗体结合,具有一定的免疫学活性。 相似文献
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为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp5基因在酿酒酵母中表达后蛋白的定位位置,以此揭示PRRSV在感染细胞中获取囊膜的位置信息,本研究首先将gp5基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35的gfp基因上游,构建重组质粒pUG-gp5-gfp,电击导入酿酒酵母CEN.PK2中,经尿嘧啶缺陷型营养筛选,获得重组酵母pUG-gp5-gfp/CEN.PK2,在甲硫氨酸营养缺陷培养基诱导表达后,荧光显微镜观察显示,gp5-gfp融合基因在酿酒酵母中获得表达,所表达的融合荧光蛋白主要聚积位置与内质网和质膜的定位模式一致,表明GP5蛋白信号肽在酵母中起到了导向作用,揭示了PRRSV在宿主细胞中获得囊膜的可能位置。该研究为其他病毒在宿主细胞中的组装位置研究提供新的思路。 相似文献