抗菌肽D基因转化广东桑的研究(初报)

采用前文[1]报道的广东桑转基因技术方法,由叶盘法将人工合成柞蚕抗菌肽D基因导入广东桑。抗菌肽基因由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒携带,对桑树叶盘进行感染和转化,并通过施加Km选择压力,经过诱导和分化,得到了Km~R表型的桑树转化苗。通过桑树叶片胭脂碱合成酶活性电泳检测及其DNA与α—~(32)P—dCTP标记的含抗菌肽基因的探针作点杂交,初步判断柞蚕抗菌肽D基因已在转化细胞中整合,为培育桑树抗青枯病品种奠定了基础。     

柞蚕抗菌肽D基因在酵母中表达的研究

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能，人工合成抗菌肽Ｄ基因（１２２ｂｐ）与含α－因子及前导肽序列的穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２重组，克隆于酵母ＡＢ１０３。在缺亮氨酸的ＹＥ培养基中筛选Ｌｅｕ＋阳性的转化子。转化子菌株培养扩增后提取重组质粒与抗菌肽基因片段探针作点杂交为阳性，电泳后插入含抗菌肽Ｄ基因１２８ｂｐ的区带。在转基因酵母的发酵液中分离上清液，浓缩，对抗菌肽敏感的指示菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１有明显抑菌效应。证实人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因在酵母中表达。     

转柞蚕抗菌肽D基因辣椒的目的基因及表达产物检测

应用现代生物技术,从核酸和蛋白质水平对转柞蚕抗菌肽D基因辣椒第4代的目的基因进行了检测。发现所分离的柞蚕抗菌肽D基因与原设计的序列一样;辣椒组织中也含有抑菌物质,经与天然抗菌肽D对比,表明抗菌肽D基因得到了表达。     

抗菌肽D基因导入柑桔及转基因植株的鉴定

由根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)的Ti质粒携带柞蚕抗菌肽D基因(122bp)感染红江橙外植体,经卡那霉素敏感性筛选及报告基因胭脂碱合成酶的电泳检测,获得若干转化苗;再经同位素标记的抗菌肽D基因为探针做点印迹杂交及Southern印迹杂交,均为阳性,证明抗菌肽D基因转化于红江橙幼苗获得成功。     

抗菌肽生物工程及其应用

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能。根据其氨基酸序列设计、合成抗菌肽D及CAD基因,转化于作物,包括烟草、辣椒、马铃薯、水稻、桑树及柑桔等,已培育出抗病株系及品种。抗菌肽基因转化于酵母中表达,通过发酵生产重组抗菌肽,代替抗生素用作饲料添加剂饲喂肉鸡、仔猪及对虾,对预防疾病、提高存活率、增加体重及降低料肉比有较好效果,已经在生产中应用。用抗菌肽配制成口腔及阴道消毒洗涤剂,能预防呼吸道疾病及阴道炎症。用抗菌肽制剂与生长因子配制成多种化妆品,已投放市场,取得较好经济效益。     

蚕抗菌肽研究与产业化35年的回顾和展望

1981年国内研究者首次从中国柞蚕(Antheraea pernyi)蛹血淋巴中分离出抗菌肽,测定其序列约37个氨基酸残基。之后又设计合成了柞蚕抗菌肽D、AD及CAD,并且在酿酒酵母、毕赤酵母及芽孢杆菌中得到高效表达,通过优化培养基配方及建立先进的发酵工艺流程后生产的蚕抗菌肽产品质量稳定。目前国内已有广东、河南、山东及湖北等省的多家生产蚕抗菌肽的企业,产品已应用于农业、养殖业、医药、食品、化妆品等领域。例如:蚕抗菌肽代替抗生素作为安全、无药物残留、不污染环境的绿色饲料添加剂用于饲养肉鸡、肉猪及对虾等,能有效预防疾病,提高成活率,增加体质量,降低料肉比;将蚕抗菌肽基因转化作物培育抗病品种,其中转入抗菌肽基因的抗青枯病辣椒品种已在广东、广西2个省(区)推广应用。今后需要进一步通过建立先进、高效的蛋白质重组技术和发酵工程技术,完善蚕抗菌肽产业化开发应用过程的相关标准、法规,努力推进蚕抗菌肽这一绿色生物制品发挥其潜在的巨大经济效益。     

蚕抗菌肽的诱导及功能的研究

一、昆虫抗菌肽的诱导 1974年,瑞典Boman等首先发现将大肠杆菌注射于惜古比天蚕蛹,能诱导血淋巴产生具有广谱杀菌作用的抗菌肽。1981年,黄自然等报道注射大肠杆菌于滞育柞蚕蛹,诱导产生溶菌酶及抗菌肽。1982年,屈贤铭等分离了柞蚕抗菌肽的多个成员并分析了抗菌肽B及D的一级结构。同年,祁国荣等首次     

二化性多丝量柞蚕新品种80-2培育成功

<正> 由吉林省蚕业科学研究所和辽宁省西丰县安家沟柞蚕场联合培育的二化性多丝量柞蚕新品种80-2是采用“小黄皮”与“河六号”两品种杂交,经9年18代定向选择培育而成。 该品种茧质优良,生活力较强,是目前我国茧层率较高的二化性多丝量柞蚕新品种。通过小区试验和母种繁育,茧层率达14％,农村大面积生产达13％。茧丝长1254m,百粒茧纤维公量114.80克,比东北现行品种青六号高21.60克。80-2茧解舒率40％,茧丝公量纤度5.49D,鲜茧出丝率8.23％。     

抗菌肽Cecropin D基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析

为使抗菌肽Cecropin D在巴斯德毕赤酵母中高效表达,本研究根据Cecropin D全基因序列和毕赤酵母的偏嗜性设计合成4条寡聚西核苷酸,SOEing-PCR技术法合成Cecropin D基因序列,并克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒,将其线性化后电击转化毕赤酵母菌株SMD1168,经高浓度博莱霉素筛选,获得高拷贝转化子,菌液PCR鉴定表明Cecropin D基因已整合到酵母基因组中.在GAP强启动子调控下,重组Cecropin D高效分泌表达,产物耐高温耐酸碱,并对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果,对E.coliDH5 α和S.aureus Cowan I株的MIC值分别为2.17 μg/mL和4.55 μg/mL.     

柞蚕抗力肽D转基因酵母的培养及表达产物的分析

采用碱金属法（醋酸锂盐），以大肠杆菌-酵母穿梭质粒表达载体在酵母中表达人工合成的柞蚕抗菌肽D基因。用电泳及抗菌肽活性检测法对表达产物进行分析。同时研究了转基因酵母的发酵条件，如温度,pH及营养等对酵母表达的影响。试验结果表明转基因酵母表达产物为1.14mg/L培养液，杀菌活力为0.216单位。     

转抗菌肽基因的柑桔遗传转化研究

柑桔是我国最重要的果树树种之一,绝大部分产区流行的柑桔溃疡病给柑桔业带来巨大的损失。柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌能力,我们的预备试验表明,它对柑桔溃疡病病原菌Xanthomonas campestris pv.Citri有很强的抑菌效应,本文报道以柞蚕抗菌肽基因转化柑桔的一些结果。     

中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

将中国林蛙皮肤抗菌肽基因(RC)克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,使之准确融合于а交配因子分泌信号,然后通过电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-,构建pPIC9K/RC。将筛选出的高效表达的重组转化子用甲醇作诱导剂进行小瓶发酵,28～30℃诱导后,经Tricine SDS-PAGE检测,表达产物在а信号因子引导下分泌到培养基中。分泌到培养基中的表达产物能够抑杀细菌和抑制肿瘤细胞生长。对酵母重组子用酵母染色体DNA的通用引物和目的片段的引物进行PCR扩增。结果表明,中国林蛙皮肤抗菌肽基因能以单拷贝整合到毕赤酵母染色体基因组中并形成转录产物。     

柞蚕强健性品种“抗大”的选育及杂交组合“抗大×8821·8822”的选配

运用柞蚕抗病、稳产性状的遗传相关性及基因重组原理,进行纯种选育和杂交组合评选,育成了强健性柞蚕新品种抗大并组配抗大×8821.8822杂交组合。新品种抗大对柞蚕核型多角体病毒的感染抵抗能力分别是选大1号的5.62倍和大三元的5.58倍,对柞蚕链球菌的感染抵抗能力分别是选大1号的6.76倍和大三元的4.37倍。杂交组合抗大×8821.8822在秋季的千粒种茧产量为226.9 kg,较对照品种大三元增产10.9%,并且具有发育整齐、营茧集中、耐粗饲料、稳产性好的特点,已在二化性柞蚕区大面积放养。     

蚕抗菌肽对阴道毛滴虫的杀灭作用

本研究用E.Coli K_(12)D_(31)诱导中国柞蚕(Antherae Pernyi) 3—5天,从血淋巴中分离和纯化出抗菌肽(含36个氨基酸残基),观察抗菌肽对阴道毛滴虫的抑制和杀灭作用。实验分三组:分別为抗菌肽组、未经诱导的柞蚕血淋巴组和灭滴灵组。结果显示:在光学显微镜下,抗菌肽作用2分钟后即可完全抑制滴虫活动,未经诱导的蚕血淋     

从柞蚕蛹提取、纯化抗菌肽的研究

本文通过实验,得出了高效率的中国柞蚕蛹抗菌肽D的分离提纯方法。据报道,抗菌肽D的热稳定性较好,而且其等电点有别于其他的杂蛋白,因而,本文用选择性热变性作为抗菌肽D分离提纯的第一步,选择性热变性的最优条件是:PH4.2的诱导血淋巴在90℃水浴加热5’;然后把PH值从4.0调到8.0,大量杂蛋白沉淀     

抗菌肽M50基因在Bac-To-Bac杆状病毒系统中的表达

将镰形扇头蜱体内的抗菌肽M50全长基因,克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-M50,并将其转化DH10Bac细胞后,得到重组穿梭质粒reBacmid-M50,再转染到sf9昆虫细胞,进行M50重组蛋白的表达,用Western blot和间接免疫荧光等方法对表达的蛋白进行鉴定。结果表明M50基因在Bac-To-Bac杆状病毒系统中成功表达。带His标签的重组蛋白分子量约为15 kDa,在昆虫细胞中表达的M50蛋白能被抗原核表达的M50蛋白的血清识别,也能被标签His单抗识别。     

强健性柞蚕新品种抗大及抗大×(8821·8822)的饲料效率比较试验

柞蚕新品种抗大及抗大×(8821·8822)是辽宁省蚕业科学研究所自1994年开始,经过十年的选择培育而成的强健性柞蚕新品种.在纯种选育和杂交组合评选中,按照育种程序,进行了新品种的实验室品种比较试验.     

新型抗菌肽Hadrurin基因的克隆与表达

Hadrurin是一种分离自毒蝎的高活性抗菌肽,对多种细菌有较强抑制活性.本试验构建Hadrurin全基因并在其两端加入了可切除的保护性多肽基因;再酶切Hadrurin基因产生黏性末端并连入pET-32a(+)原核表达载体;IPTG诱导表达抗菌肽蛋白,亲和层析纯化抗菌肽蛋白.结果表明,构建的Hadrurin全基因片段序列完全正确,连接进入pET-32a(+)表达载体的基因由0.1 mmol/L终浓度的IPTG诱导5 h可达到表达的高峰,重组蛋白经亲和层析可到达纯化的目的.     

柞蚕溶菌酶真核表达系统的构建及重组蛋白纯化分析

利用甲醇营养型毕赤酵母对柞蚕溶菌酶进行高效重组表达。首先根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶成熟肽基因进行密码子优化,将优化后的基因序列ApLyz克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,构建重组表达载体pPICZαA-ApLyz。重组载体经电转化整合入毕赤酵母菌株GS115基因组中,并利用高质量浓度Zeocin(500μg/mL)抗性平板筛选得到高拷贝转化子。摇瓶发酵显示,甲醇诱导72 h后,高拷贝菌株发酵液中溶菌酶活性为450 U/mL(313 U/mg总蛋白),酶活约为单拷贝菌株的3.1倍。纯化后的重组柞蚕溶菌酶分子质量约14 kDa,酶活为3 870 U/mL,比酶活为20 262 U/mg。酶学性质分析显示,重组柞蚕溶菌酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.5,具有较好的热稳定性。     

柞蚕强健性品种“抗大”的选育及杂交组合“抗大&#215;8821&#183;8822”的选配

运用柞蚕抗病、稳产性状的遗传相关性及基因重组原理,进行纯种选育和杂交组合评选,育成了强健性柞蚕新品种抗大并组配抗大&#215;8821&#183;8822杂交组合,新品种抗大对柞蚕核型多角体病毒的感染抵抗能力分别是选大1号的5．62倍和大三元的5.58倍,对柞蚕链球菌的感染抵抗能力分别是选大1号的6．76倍和大三元的4.37倍,杂交组合抗大&#215;8821&#183;8822在秋季的千粒种茧产量为226．9kg,较对照品种大三元增产10．9％,并且具有发育整齐、营茧集中、耐粗饲料、稳产性好的特点,已在二化性柞蚕区大面积放养。