番茄果实特异性表达有机磷水解酶的农药降解活性分析

为研究番茄果实中表达有机磷水解酶(OPH)降解有机磷农药的活性,经农杆菌介导,将携带表达元件E8-OPD的植物表达载体pSE8OP遗传转化番茄子叶,通过抗性筛选和分子检测,获得6株GUS染色和PCR扩增阳性的转基因番茄植株。酶活分析发现,酶促反应最适温度为30℃,稳定性较高。酶的最适保存pH值为9,最适试验pH值为8.0。与1 mmol/L Zn2+条件下酶活相比,Co2+提高了酶活2.1倍,Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、EDTA、SDS、TritonX-100、β-ME和DTT都不同程度地抑制了酶活。检测重组表达OPH降解蝇毒磷、毒死蜱和对硫磷的酶活。表明,降解蝇毒磷的Km最低,为4.04μmol/L。重组表达OPH有助于提高番茄果实降解有机磷农药残留的能力。     

有机磷降解酶在烟草中的高效表达研究

有机磷化合物在农业生产中作为杀虫剂被广泛使用,在使用的同时也造成大面积的污染.本研究在烟草中表达细菌来源的有机磷降解酶基因ophc2,将有机磷降解酶分泌到植物体外,希望通过植物根系降解环境中的农药残留.构建了植物表达载体,包含CaMV 35S启动子序列、extensin序列、有机磷降解酶编码基因ophc2和nos终止子序列,命名为pBI-E-opphc2.胡萝卜extensin 基因的信号肽序列引导ophc2基因表达产物分泌到胞外.经过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）,共获得101株转化植株,PCR检测证实有80株含有目的基因片段.从80株中随机挑选60株经western杂交检测,有24株呈阳性.酶活性测定实验结果表明,转基因植株可以释放有机磷降解酶到培养基中,并且具有有机磷水解酶活性.对于转基因植物降解培养介质中和吸入植株中的有机磷农药的实际效果将在以后报道.     

二氧化硅纳米花固定化酶及其有机磷农药降解性能

有机磷农药在蔬菜、水果及土壤中的残留严重影响了环境和人类的身体健康。有机磷水解酶(organophosphate pesticides, OPH)能高效降解有机磷类化合物残留，利用具有开放孔道的二氧化硅纳米花固定有机磷水解酶，可以优化固定化条件，固定化OPH的最适温度为45℃,最适pH值为8,与游离OPH相比，在温度为35～55℃、pH值为7.5～9.0的范围内均能保持较高的催化活性。与游离有机磷水解酶相比，固定化有机磷水解酶具有更好的热稳定性、pH值稳定性和重复使用性。研究结果表明，固定化酶在保证降解效率的同时，可有效降低有机磷水解酶的使用成本，是一种具有发展前景的固定化酶降解有机磷农药技术。     

有机磷水解酶对不同有机磷农药降解功效的评价

通过2种检测方法测定了有机磷水解酶对不同有机磷农药的降解功效,一种方法是通过气相色谱法直接检测降解产物中农药的残留量来评价有机磷水解酶对不同农药的降解功效;另一种方法是利用有机磷类农药可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性,受抑制的胆碱酯酶不能将靛酚乙酸酯(红色)分解为靛酚(蓝色)和乙酸的原理,通过测定有机磷水解酶降解后有机磷农药的残留量对胆碱酯酶的抑制作用来评价有机磷水解酶对不同有机磷农药的降解功效。研究结果发现:有机磷水解酶对甲基对硫磷、对硫磷、喹硫磷和敌敌畏具有高效降解作用,降解率在82.2%～98.7%;其次是氧乐果、久效磷和敌百虫,降解效率在28.1%～45.4%;其他的降解效率均在20%以下。     

有机磷农药在土壤环境中的降解转化

有机磷农药属于目前使用最为广泛的一类农药。由于其在土壤中的残留会影响到人体的健康,因此研究有机磷农药在土壤环境中的降解转化对评价有机磷农药和改进有机磷农药有一定的积极意义,同时对消除土壤环境中的有机磷农药污染也具有一定意义。因此,文章在了解有机磷农药性质的基础上分析其降解转化机制,并分析其三种降解过程,分别为光降解转化、化学降解转化、微生物降解转化三种。     

来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶基因的克隆

有机磷化合物作为一类高效广谱的杀虫剂被广泛使用,在使用的同时也造成了大面积的环境污染。本研究从被农药高度污染的土壤中筛选到了一株对甲基对硫磷农药有高效降解能力的细菌,通过16S rDNA鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。克隆该菌的有机磷降解酶编码基因mphxw,构建原核表达载体,其表达产物具有正常生物学活性,同时纯化了重组酶。     

有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测

甲基对硫磷是一种毒性较强的有机磷农药,常被用作菜农用作杀虫剂,有机磷水解酶可通过切断甲基对硫磷中的■键实现对甲基对硫磷的快速、高效降解。通过对有机磷水解酶降解条件进行优化,得到有机磷水解酶最优的农药降解条件:酶浓度为1∶1 000、pH值为8、降解温度为37℃、降解时间为10 min。通过气相色谱法测得有机磷水解酶对1、5、10μg/mL甲基对硫磷的降解率均达到98%以上,因此在生产中有机磷水解酶可作为针对甲基对硫磷的高效快速降解酶进行推广使用。     

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu表达载体构建及遗传转化

为了进一步优化黄瓜遗传转化体系,提高遗传转化效率,构建含有自身启动子的黄瓜果瘤基因(Tu)表达载体pCAMBIA2301-Tu,将表达载体通过电击法导入农杆菌菌株GV3101中,进行农杆菌介导的黄瓜遗传转化的研究。使用限制性内切酶KpnI和BamHI对质粒pCAMBIA2301和Tu基因PCR产物进行双酶切,回收目的片段,连接后成功构建Tu基因表达载体。通过优化遗传转化的生根条件以及抑制农杆菌生长条件,一定程度上提高了遗传转化的效率。580个外植体通过抗生素筛选获得的18株再生苗进行PCR检测和测序鉴定,最终获得8株阳性转化苗,转化效率为1.37%。     

有机磷农药降解酶制剂研制成功

中国农业科学院生物技术研究所承担的有机磷农药降解酶制剂研制课题,近日通过农业部组织的成果鉴定。据介绍,科研人员从被污染的土壤中筛选出一株能够降解多种有机磷农药的细菌,并克隆了有机磷降解酶的编码基因对其进行分子改造。该系统的有机磷降解酶表达量达到6 g/L,是国内外目前报道的有机磷降解酶最高的表达量。研究表明,表达有机磷降解酶的重组毕赤酵母具有良好的安全性,无抗药性标记,培养过程中不分泌有毒物质。而且利用分泌表达载体可使有机磷降解酶成功分泌到胞外,简化了酶的后加工工艺,降低了成本。有机磷农药降解酶制剂研制成功@…     

有机磷农药广谱降解菌A1A18菌株(Brevundimonas sp.)的筛选、鉴定与降解特性分析

从宁夏有机磷农药污染土壤中筛选对毒死蜱、氧化乐果和水胺硫磷等3种常用有机磷农药残留具有降解能力的菌株,确定其降解能力的代际稳定性及其对土壤中有机磷农药的降解特性。采用选择培养法和牛津杯法筛选目标菌株,依据细菌形态学特征、生理生化反应及分子测序结果进行分类鉴定,气相色谱法检测液体培养环境和土壤中有机磷农药的残留量。结果表明:分离、筛选获得1株有机磷农药广谱降解菌A1A18菌株,鉴定为短波单胞菌属(Brevundimonas sp.);在液体培养环境中,A1A18菌株对毒死蜱、氧化乐果和水胺硫磷3种有机磷农药的降解率分别为45.82%、9.52%和13.96%;经10代培养,确定该菌株对3种有机磷农药的降解能力具有很好的遗传稳定性。在有机磷原药质量分数为1.0 mg·kg~(-1)干土的土壤中施用A1A18菌株,降解菌初始数量密度为0.2×10~8 CFU·g~(-1)干土,施药后第21天,土壤中毒死蜱和水胺硫磷的降解率分别达到88.81%和87.75%,较对照提高16.24%和24.62%;施药后第7天,土壤中氧化乐果降解率达86.19%,较对照提高12.69%。短波单胞菌A1A18菌株能促进土壤中毒死蜱、氧化乐果和水胺硫磷的降解,具有较好的田间应用潜力。     

细胞表面展示有机磷水解酶的恶臭假单胞菌工程菌的构建及全细胞酶活性分析

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)冰核基因的N-末端(inpn)作为锚定单元(anchoring mo-tif),通过与来自黄杆菌属(Flavobacterium sp.)的有机磷水解酶基因(opd 构建融合基因inpn-opd,并连接于假单胞菌表达载体Pymbp,然后导入恶臭假单胞菌(P.putida)野生型菌株AB92019,获得了能在其细胞表面展示有机磷水解酶并具有全细胞酶催化活性的重组工程菌MMBL-opd.SDS-PAGE结果表明,融合基因能表达产生80 ku的蛋白质.重组菌MMBL-opd在无抗性LB固体培养基上能稳定生长,所携带的外源质粒的稳定性达到100%;在添加100 μmol/L Go2 培养基上28℃培养48 h,表面展示的有机磷水解酶具有最高全细胞酶活性,为0.036 U/mg.用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低92%.重组菌在PBS缓冲液中于4℃条件下保存30 d,仍能保持93%的全细胞酶活.     

抗黄瓜花叶病毒RNAi载体的构建及烟草的转化

[目的]构建抗黄瓜花叶病毒RNAi载体,并将载体转入烟草。[方法]采用RT-PCR方法,扩增黄瓜花叶病毒NS04加工番茄分离物的RNA2基因组的序列。选取CMVRAN2基因组中的复制酶片段作为靶序列,构建pBi35SCR2真核表达载体,并对表达载体进行鉴定;通过农杆菌介导的方法将表达载体转入烟草,用PCR的方法检测载体是否转入。[结果]系统进化树分析结果表明,RNA2中编码CMV-2a的序列与中国浙江的DQ412731分离物有较高核苷酸及氨基酸同源性,分别达到98.0%和96.5%;PCR结果表明,试验成功构建了pBi35SCR2真核表达载体,并成功将表达载体转入烟草。[结论]试验获得的转基因烟草可作为后期攻毒试验的材料,并为研究加工番茄抗黄瓜花叶病毒奠定了基础。     

诱导提取的dsRNA粗提液对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抑制作用

在已测序的黄瓜绿斑驳花叶病毒运动蛋白基因序列的基础上,设计特异引物,扩增全长基因,将其插入到原核表达载体L4440的2个T7启动子之间,构建能诱导形成双链RNA (dsRNA)的原核表达载体L4440-MP,并转化大肠杆菌HT115(DE3),经IPTG诱导,提取了高质量的dsRNA.将提取的dsRNA对黄瓜进行抗病性...     

黄瓜花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

对侵染烟草的黄瓜花叶病毒(CMV)山东分离物(SD1)的外壳蛋白(CP)基因进行克隆和序列分析。根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成两条寡聚核苷酸引物,用免疫捕捉PCR的方法对黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因进行了扩增。将所得的PCR产物通过T4DNA连接酶连接到pET-22b(+)载体上,并转化大肠杆菌DH5α。序列分析表明:CMV-SD1的CP基因全长657bp,编码218个氨基酸;其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ的分离物有极高的同源性,达92.7%~94.9%;与亚组Ⅱ的同源性仅为59.3%~59.5%;由此将CMV-SD1分离物归属于CMV亚组Ⅰ。     

黄瓜ZYMV抗性鉴定与抗性基因的分子标记辅助选择

近年来,小西葫芦黄化花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)在黄瓜(Cucumis sativus L.)上危害愈发严重,影响黄瓜植株的生长发育,降低黄瓜的产量与品质。由于ZYMV缺乏有效的防治药剂,因此需要培育ZYMV抗性黄瓜品种。以ZYMV Z5-1为病毒源,对不同黄瓜材料的ZYMV抗性进行鉴定,并对抗性位点候选基因进行了测序分析。结果显示,黄瓜品种SA02、SA06、S94、S1003、WI7230与TMG-1具有ZYMV抗性,其抗性候选基因Csa6G152960.1的突变位点一致。在ZYMV抗性鉴定的基础上,通过回交转育,将黄瓜自交系TMG-1中的ZYMV抗性基因转入感病自交系SA0422中,回交期间利用分子标记对回交群体进行前景选择和背景选择,经过3代回交,将ZYMV抗性基因转入SA0422,为培育抗ZYMV黄瓜新品种奠定了基础。     

黄瓜磷脂酶D基因片段克隆及其反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法,从新泰密刺黄瓜的幼叶中得到长为1018 bp的cDNA片段,编码339个氨基酸,与GenBank中甜瓜磷脂酶D基因相比核苷酸同源性为96%,氨基酸同源性为97%.克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构成磷脂酶D基因的反义表达载体.     

农杆菌介导iaaM基因黄瓜遗传转化体系的建立

以已经建立的高频黄瓜再生体系为基础,从影响黄瓜转基因体系的农杆菌侵染时间,共培养时是否加入乙酰丁香酮等因素优化了黄瓜遗传转化体系;将单性结实基因iaaM以农杆菌介导法导入到东农649品种黄瓜子叶节中,经过不定芽诱导和生根等过程获得了转基因株系,通过特异性引物的PCR鉴定,40个株系扩增出iaaM目的基因片段。PCR-Southern检测为阳性。转基因阳性植株移栽到温室中,其果实经检测80%为单性结实黄瓜。