来源于Selenomonas ruminantium的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

 应用酶解效率更高的高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的有效途径。根据毕赤酵母对于密码子的选择偏向,对来源于原核瘤胃微生物Selenomonasruminantium的高比活植酸酶基因phyS进行了密码子优化,将优化后的植酸酶基因phyS(m)与未优化的phyS插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在摇瓶水平上,phyS(m)的表达水平比phyS高10倍。在5L发酵罐中,优化后的植酸酶基因phyS(m)其蛋白表达量达到4mgml-1发酵液,效价达到1.6×106I     

热稳定性对甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌的影响

甲基对硫磷水解酶可生物降解有机磷农药,由于其特殊的应用价值,越来越受到人们的关注。来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶MPH-Och在毕赤酵母系统中不能有效地分泌表达。将热稳定性提高的突变体MPH-S274Q在毕赤酵母中表达,发现其毕赤酵母重组菌株经摇瓶诱导培养120 h后,培养上清的酶活力达到0.7 U/mL,蛋白分泌量是野生型的14倍,SDS-PAGE电泳图中培养上清有明显的蛋白质条带,进一步证明了分泌效率提高,该结果表明提高蛋白质的热稳定性可以作为提高外源蛋白在毕赤酵母中的分泌效率的一条有效途径。     

普鲁兰酶基因工程研究进展

普鲁兰酶是一类淀粉脱支酶,能够专一性地切开支链淀粉分支中的α-1,6-糖苷键,形成直链淀粉。普鲁兰酶能够与其他淀粉酶协同作用,主要应用在以淀粉为原料的食品加工中,大规模地提高了淀粉的利用率和生产效率。目前已获得的普鲁兰酶在大肠杆菌、芽胞杆菌以及毕赤酵母表达系统中均实现了表达,然而其表达水平难以满足工业生产的需要。着重从普鲁兰酶的异源表达及优化、酶蛋白分子改良方面对近几年普鲁兰酶最新的研究进展进行了综述,为寻找更有效提高表达量的途径提供理论基础。     

立体分子伴侣-脂肪酶特异折叠酶

细菌脂肪酶是一类重要的工业用酶,尤其以来源于假单孢杆菌Pseudomonas与伯克霍尔德菌Burkholderia的脂肪酶应用最为广泛。然而,这类脂肪酶折叠过程中存在一个巨大的能障而无法自发正确折叠。研究发现,这类脂肪酶的编码基因所在操纵子中往往存在一个与其折叠相关的基因,编码一种脂肪酶特异折叠酶。该类蛋白为脂肪酶的立体分子伴侣,可与脂肪酶的折叠中间体相互作用,帮助脂肪酶越过折叠过程中的能量障碍,为其获得正确构象提供必要的空间信息。详细阐述了脂肪酶特异折叠酶的发现、分类、作用机制与应用前景。     

来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶基因的克隆

有机磷化合物作为一类高效广谱的杀虫剂被广泛使用,在使用的同时也造成了大面积的环境污染。本研究从被农药高度污染的土壤中筛选到了一株对甲基对硫磷农药有高效降解能力的细菌,通过16S rDNA鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。克隆该菌的有机磷降解酶编码基因mphxw,构建原核表达载体,其表达产物具有正常生物学活性,同时纯化了重组酶。     

有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因和微生物多样性研究

采用珠磨法直接从受有机磷污染的土壤和活性泥样品中提取和纯化宏基因组DNA。根据有机磷降解酶基因保守区设计引物,从宏基因组中扩增有机磷降解酶基因片段。回收扩增产物后,构建了以pEASY-T3为载体的有机磷降解酶基因片段文库。从文库中随机挑选克隆进行DNA序列测定,并分析测序结果,评价有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因的多样性和新颖性。结果显示,88%土壤来源序列与GenBank中同类酶序列相似性在44%~65%之间,97%活性泥来源序列与GenBank中同类酶的相似性在23%~77%之间,且序列多样性极为丰富,显示在有机磷污染土壤和活性泥中含有丰富和新颖的有机磷降解酶基因资源。同时采用PCR-DGGE的方法对有机磷污染土壤和活性泥中微生物多样性进行了初步研究。     

来源于假单胞菌4-硝基酚降解基因簇中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因克隆和功能鉴定

通过富集培养的方法从农药厂废水曝气池的活性污泥中筛选到了一株既具有甲基对硫磷降解活性又可以有效降解4-硝基酚的高效菌株1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。根据4-硝基酚降解相关基因保守区设计简并引物扩增小片段,再应用TAIL-PCR克隆得到偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1,基因全长873 bp,编码290个氨基酸,酶蛋白理论分子量为32.8 kDa。 doi1基因在E. coli BL21中过量表达,并通过Ni-NTA亲和层析纯化,结果表明该酶具有正常的生物学活性,证明了假单胞菌1-7可以通过偏苯三酚途径降解4-硝基酚。初步探讨了假单胞菌1-7的4-硝基酚降解机制。     

苏云金芽孢杆菌HD -1δ- 内毒素蛋白的纯化及其单克隆抗体细胞株的建立

从苏云金芽孢杆菌HD-1伴胞晶体中分离得到的毒素蛋白经过Sepharose 6B和DEAE Sephadex DE-52得到了纯化,纯化后的蛋白在SDS-PAGE上呈现一条带,其分子量约为68000。用纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术建立了抗HD -1δ- 内毒素蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经过半年的体外培养,大多数细胞株仍能持续分泌高滴度的单克隆抗体。文中还讨论了抗体的特异性及理化特性。此单克隆抗体细胞株的建立将为植物基因工程产物的检测提供有力工具。     

马铃薯抗晚疫病研究进展

1前言晚疫病是马铃薯主要病害之一，在全球范围内绝大数栽培马铃薯的冷凉地区广泛传播。19世纪中叶，晚疫病大流行使800万以马铃薯为主食的爱尔兰人口因饥饿或移民失去1／4，进入20世纪80年代，晚疫病在世界各地马铃薯种植区的频频发生，再次引起了国际社会的极大关注。早在199     

通过正交实验设计突变体组合提高甲基对硫磷水解酶OPHC2对乙基对硫磷的降解能力

分别自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes C2-1)和假单胞菌（Pseudomonas sp. 1-7）中克隆得到甲基对硫磷水解酶基因ophc2和ophc3,其编码甲基对硫磷水解酶OPHC2和OPHC3的氨基酸序列相似性达98.5%,仅5个氨基酸残基不同,但酶学性质差异很大,特别是对不同底物降解特性有很大差异。OPHC2对甲基对硫磷的催化效率是OPHC3的2.75倍,对乙基对硫磷的催化效率仅为OPHC3的12.9%。为了提高OPHC2对乙基对硫磷的降解活性,以OPHC3的序列为依据,针对5个不同的氨基酸设计正交实验,对OPHC2进行组合突变,最终获得了一个突变体P165S/A169V,对乙基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.19倍,对甲基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.36倍。