水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5'∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5')的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化。[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5'∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

烟草atp9基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

atp9基因是烟草的雄性不育相关基因。为研究atp9基因的功能及其在烟草雄性不育形成中的作用,根据atp9基因全长序列,设计特异性引物,扩增正、反义干扰片段,将长度为239bp的atp9基因的正、反向干扰片段分别连接到linker片段的两侧,最后插入到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功地构建了atp9基因的RNAi表达载体。利用农杆菌介导法将其转化烟草保持系品种中烟90,结果证明atp9基因的RNAi表达载体已整合到中烟90基因组中。经抗性筛选以及分子检测最终获得41株转pCAMBIA1301-atp9-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有20株,转化率为48.8%。研究结果为下一步验证atp9基因的功能及其在烟草雄性不育形成中的作用奠定了基础。     

水稻OsAPX基因的克隆及过表达载体的构建

通过RT-PCR法从粳稻日本晴中克隆到ascorbate peroxidase(APX)基因,该基因的cDNA长为768bp,包含完整的CDS序列。将克隆到的片段连接到植物表达载体pBI121的相应位置,构建1个APX基因的过表达载体pBI121-APX。利用农杆菌EHA105介导该植物表达载体在籼稻"多系1号"和"航1号"中的遗传转化,以期成功获得转基因植株,为后期研究APX基因在水稻耐储藏方面所发挥的功能打下基础。     

甘蓝抗枯萎病基因FOC1植物表达载体构建及遗传转化

为研究甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的抗性功能,利用前期克隆的FOC1基因,以pBI121质粒为植物表达载体,采用同源重组法构建FOC1基因的过表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并通过农杆菌介导的甘蓝外植体转化法对感病甘蓝进行遗传转化,利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。结果表明,最终成功构建FOC1基因的过表达载体pBI121-35S-FOC1,并已成功整合到受体甘蓝基因组中。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化(英文)

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5′∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5′)的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5′∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

一个耐硒基因过表达载体的构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步验证WRKY47基因在调控硒胁迫应答中的功能,构建WRKY47过表达载体,获得相应的转基因株系。[方法]以野生型拟南芥的c DNA为模板,利用PCR扩增WRKY47基因全长,将该基因连接到p BI121载体上。将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸化转化法将WRKY47重组质粒转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得WRKY47转基因阳性植株。[结果]扩增获得WRKY47基因,CDS全长1 470 bp,连接转化并获得测序正确的重组载体p BI121-WRKY47。通过抗性筛选和分子鉴定获得阳性转基因植株。[结论]成功构建过表达载体并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础。     

金发草LEA3基因2个剪接体转化烟草的抗干旱胁迫能力分析

【目的】为进一步鉴定金发草LEA3基因2个剪接体蛋白亲水能力和结构上的改变导致在抗逆能力方面的差异。【方法】本研究利用植物表达系统分析了2个剪接体在烟草体内的功能以及功能之间的差异。以PpLEA3基因2个剪接体(PpLEA3.a和PpLEA3.b)的重组载体pMD19-T-PpLEA3.a和pMD19-T-PpLEA3.b为模板,PCR法构建植物表达载体pBI121-PpLEA3.a和pBI121-PpLEA3.b,并分别转化烟草得到转基因烟草Nt-PpLEA3.a和Nt-PpLEA3.b。【结果】首先对转基因烟草进行分子检测,发现其基因组DNA和RT-PCR检测均表现为阳性,说明外源基因已整合到烟草基因组并可以正常转录表达。随后筛出转基因烟草并收获T2代种子后,对其进行抗旱生理特性分析,发现在遭受甘露醇150 mM的模拟干旱胁迫后,转基因植株均比野生植株生长状况好,野生植株相对矮小,叶片萎蔫,生长畸形,而转基因植株整体受损情况要好很多。同时分析了此模拟干旱条件下转基因植株与野生型植株的丙二醛含量、叶绿素含量和相对电导率的变化。【结论】转基因烟草在干旱胁迫下表现出良好的耐受性,耐受能力PpLEA3.aPpLEA3.b。进一步说明序列上的差异对基因的抗干旱能力功能起着重要作用。     

马铃薯StSUT2基因在烟草中过表达提高其耐盐性

【目的】为明确马铃薯蔗糖转运蛋白(SUT2)对盐胁迫的响应,本研究对StSUT2的功能进行初探。【方法】通过同源克隆技术得到马铃薯StSUT2基因并进行生物信息学分析,使用荧光定量PCR技术检测马铃薯青薯9号不同器官中SUT2基因在盐胁迫下表达量的变化,随即构建表达载体并遗传转化烟草,测定转基因烟草在盐胁迫下脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量的变化。【结果】①马铃薯StSUT2基因CDS长度为1818 bp,编码605个氨基酸;系统进化树分析表明,马铃薯StSUT2与番茄亲缘关系最近。②马铃薯StSUT2基因可被盐胁迫诱导,其中根、茎中的表达量在胁迫8 h最大,而叶中的表达量在4 h最大。③构建表达载体pJAM1502-StSUT2并转化烟草,经PCR和qRT-PCR鉴定,获得6株转基因植株,并选取表达量最高者进行后续实验。④盐胁迫下测定野生型与过表达植株中脯氨酸、可溶性蛋白以及可溶性糖含量发现,过表达植株中脯氨酸、可溶性蛋白以及可溶性糖含量均高于野生型。【结论】StSUT2可能会通过提高渗透性物质含量来增强植物的耐盐性。     

拟南芥PTR3基因过表达载体构建及转基因植株的获得

[目的]构建PTR3基因的过表达载体,并建立PTR3基因过表达植株,为进一步研究PTR3基因在调控重金属胁迫应答中的功能提供理论依据。[方法]提取野生型拟南芥总mRNA,并以反转录的c DNA为模板扩增出PTR3基因CDS全长,通过限制性核酸内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接,将该基因连接到带有35S启动子的p BI121载体上。[结果]将重组载体转化至农杆菌GV3101菌株,通过浸花法将重组载体转化到野生型植株中,通过抗性筛选和遗传鉴定获得纯合的PTR3转基因阳性植株。[结论]PTR3过表达载体构建成功并获得转基因阳性植株,为研究PTR3基因的分子功能奠定基础。     

蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析

 【目的】克隆蜡梅凝集素基因并研究其抗蚜虫和抗蛞蝓活性,为植物抗虫基因工程提供理论依据和试验材料。【方法】通过随机挑选克隆测序的方法,从蜡梅花cDNA文库中克隆蜡梅凝集素基因,并构建植物表达载体,用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,并对转基因植株进行抗蚜和抗蛞蝓试验。【结果】从蜡梅花cDNA文库中克隆到了一个凝集素基因CpLEC(GenBank登录号：DQ352145),该基因全长871 bp, ORF框长558 bp, 编码185个氨基酸。该基因DNA分析表明其不含内含子。具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,有2个典型的甘露糖结合位点(QXDXNXVXY),和1个变异的可能结合位点(HXGXNXVXY)。Southern杂交表明,该基因在蜡梅基因组中为多拷贝。构建了35S启动子控制下的CpLEC基因的植物表达载体pBI121-CpLEC,利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明,CpLEC基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明,转基因植株及其离体叶片有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率分别为60%和68%。抗蛞蝓试验结果表明转基因植株有明显的抗蛞蝓活性,转基因烟草虫害指数为0.17,远低于非转基因烟草的虫害指数0.96。【结论】克隆获得了蜡梅凝集素基因CpLEC,通过转基因手段分析其抗蚜和抗蛞蝓活性,结果表明该基因对抗虫基因工程有重要的应用价值。     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

马铃薯prp1-1启动子的克隆及转基因研究

采用PCR技术，从云南马铃薯叶片DNA中分离克隆到了马铃薯病程相关蛋白（prpl-1)基因启动子，与国外文献报道序列完全一致。将这一启动子亚克隆到中间载体pUC18中，再构建到植物表达载体pBI121上，以取代其原有的CaMV35S启动子，得到重组植物表达载体pBI121M；用电脉冲法将pBI121M转入农杆菌LBA4404。应用农杆菌介导法，将携带有pBI121M重组质粒的农杆菌转化烟草，经卡那霉素筛选，得到了一批转基因植株。转基因植株的PCR鉴定表明，启动子整合到了烟草植株基因组中。本研究为下一步通过X－Glu染色法检测启动子下GUS基因的表达情况，研究该启动子的病原菌特异性诱导活性，并建立新的植物转基因系统奠定了基础。     

A/O型FMDV多抗原表位融合基因植物表达载体构建及转化柱花草的研究

【目的】获得含有A/O型FMDV多抗原表位融合基因4种不同组合的转基因柱花草植株。【方法】用限制性内切酶Xba I和Sac I双酶切4个中间载体和质粒pBI121,回收连接后获得4个重组植物表达载体(pBI-xsB/xs T/xsBT/xsBTT)及相应农杆菌工程菌株,利用农杆菌介导法转化热研2号柱花草(Stylosanthes guianensis cv.ReyanⅡ)子叶叶盘。采用卡那霉素筛选,特异引物和转基因检测引物进行PCR及RT-PCR检测不同组合多抗原表位融合基因的转录情况。【结果】获得36株抗性转化株,经PCR检测有16株为阳性,RT-PCR检测后有11株为阳性,表明4种组合多抗原表位融合基因在转基因植株中获得转录。【结论】此研究为进一步揭示同型与异型FMDV之间多抗原表位基因不同融合方式的免疫原性和免疫效果奠定了研究基础。     

一个抗旱/抗寒基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究LWT1基因在调控低温和干旱应答中的功能,构建拟南芥LWT1基因过表达载体,获得相应的转基因株系.[方法]以野生型拟南芥的cDNA为模板,利用PCR扩增LWT1基因全长,将该基因连接到pART27载体上.将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸花转化法将LWT1重组载体转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得LWT1转基因阳性植株.[结果]LWT1基因CDS全长990 bp,PCR电泳结果一致,测序比对结果正确.通过抗性筛选和分子鉴定获得转基因植株.[结论]LWT1过表达载体构建成功并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础.     

烟草MARs的分离及功能鉴定

【目的】研究烟草MARs序列对外源基因表达的影响,从中筛选出能明显提高目的基因表达水平的强MARs序列。【方法】用PCR方法从烟草基因组中克隆得到3个MARs序列(TM1、TM2和TM3),将这3个MARs序列分别顺向构建到植物表达载体pBI121 GUS基因表达盒两端,经农杆菌介导转化烟草,对获得的转基因植株体内的GUS酶活性进行了定量检测,分析MARs对GUS酶活性的影响。【结果】(1)序列分析表明,TM2和TM3是两个新的MARs序列;(2)GUS酶活性的定量检测表明,TM1、TM2、TM3可以使GUS基因的平均表达活性分别提高1.4,5.1和1.3倍,但不同转化个体之间的表达水平有明显差异。【结论】虽然克隆到的3个MARs序列均可提高外源基因GUS的表达,但其并未降低转基因植株个体间外源基因表达水平的差异。     

FaGST基因过量表达获得拟南芥转基因植株

【目的】探明FaGST基因的功能和分子调控机制,为其后期的抗性利用与研究提供科学依据。【方法】利用前期构建的pCAMBIA1300-35S空载体和pCAMBIA1300-35S-FaGST过表达载体,将其转化感受态(DH5α)细胞后导入农杆菌GV3101,利用花序侵染法转化拟南芥,通过潮霉素(Hyp)进行筛选、PCR鉴定,并利用实时荧光定量PCR检测其表达量。【结果】FaGST基因成功导入拟南芥中,获得6株空载体转基因拟南芥植株和8株转FaGST基因拟南芥植株;8株转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量为1.31～2.06,较野生型拟南芥植株表达量（1.00）显著或极显著提高。【结论】成功获得拟南芥转基因纯合植株,FaGST基因在拟南芥植株中已过量表达。     

含有MAR序列的STI-STII-LTB融合基因在苜蓿中的表达

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用三引物PCR法和酶切实现了STI、STII、LTB基因的融合,LTB基因的5′位于STII基因的3′端,三者在同一阅读框。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中GUS基因的位置。同时构建不含MARs序列的重组质粒。重组质粒pBI121-MARs-STI-STII-LTB、pBI121-STI-STII-LTB通过冻融法转化根癌农杆菌,并通过农杆菌介导法转化杂花苜蓿。转基因苜蓿植株经PCR检测、Southern-blotting分析表明,转基因苜蓿植株基因组中可检测到STI-STII-LTB融合基因;提取转基因苜蓿植株总蛋白质,SDS-PAGE结果显示,转基因植株表达了重组抗原蛋白,且含MAR序列的蛋白表达量要高于不含MAR序列的表达量;Western-dotting免疫检测证实转基因植株表达的重组抗原具有免疫原性。     

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。     

雪花莲凝集素基因(GNA)植物表达载体的构建及其对烟草的遗传转化

将雪花莲凝集素基因(GNA)取代GUS基因正向插入到Ti质粒载体pBI121的35S启动子之下,构建成植物表达载体pBI121/GNA,并将其导入农杆菌LBA4404中.通过该农杆菌介导转化烟草红花大金元,得到卡那霉素抗性植株159株,PCR检测表明其中102株为阳性.对8株PCR阳性植株进行了抗蚜虫生物活性检测,抑制蚜虫密度为25%～90%.     

一个耐镉基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能,构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体,通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥c DNA为模板,PCR扩增MNB1基因全长,将该基因连接到过量表达载体上;然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,浸花法转化野生型植株;最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp,酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落,测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株,为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。