RNAi和GroEL介导的双价转基因番茄对TYLCV的抗性

本研究将已构建的SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2植物表达载体共转化番茄,共获得19株卡那霉素抗性再生植株。经过PCR和RT-PCR检测,初步获得转SUC2-GroEL载体的阳性植株5株,转pBI121-AC1-AC2载体的阳性植株3株以及转SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2双载体的阳性植株2株。利用TYLCV侵染性克隆农杆菌注射接种法对T0代转基因阳性植株进行抗性鉴定,获得抗TYLCV的转基因植株7株。对T0代未扩出病毒条带的T1代植株进行抗性鉴定,结果发现转SUC2-GroEL、pBI121-AC1-AC2、SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2不同载体的株系植株中平均带毒率依次是35%、25%和15%,推断转双基因的植株的抗病能力优于转单个基因植株的抗病能力。     

GNA和α-PAP双抗表达载体的构建及对烟草的遗传转化

将带有启动子GaMV35S、终止子Nos-ter的雪花莲凝集素基因GNA插入到已构建好的植物表达载体pBI121/α-PAP上，构建成双抗表达载体pBI121/GNA α-PAP，并采用农杆菌介导法将其转化进入烟草红花大金元，获得了卡那霉素筛选的抗性植株，通过PCR扩增验证，烟草基因组中含有这两个抗性基因。     

GNA和ACA双价转基因烟草培育及其抗蚜研究

蚜虫是一种常见的农作物害虫,作为多种植物病毒的载体而成为影响农业发展的重要害虫之一,对蚜虫的防治一直是众多科学工作者所面对的难题。构建了雪花莲凝集素(GNA)和苋菜凝集素(ACA)双价植物表达载体pBI121-GA,在农杆菌介导下,叶盘法转化烟草NC89,得到卡那霉素抗性植株65株。通过基因组PCR、ELISA、RT-PCR和Western-blot等分子生物学检测,从中筛选出外源凝集素不同表达水平的转基因烟草5株。对筛选出的5株转基因烟草植株进行初步蚜虫抗性实验,证实转基因烟草对桃蚜表现出一定的抗性,最高抑制率达85.8%,为农作物双价抗蚜基因的应用研究提供一定的理论基础。     

番茄生长素应答因子ARF1基因RNA干涉载体的构建及其对番茄的转化

将番茄生长素应答因子家族成员之一ARF1中的500bp左右的特异片段导入到植物载体pBI121中,构建成RNAi表达载体(pBI121-ARF1),通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养和抗性筛选获得再生植株.PCR检测再生植株,初步鉴定为阳性植株,为后续进一步鉴定该基因功能奠定了基础.     

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。     

马铃薯prp1-1启动子的克隆及转基因研究

采用PCR技术，从云南马铃薯叶片DNA中分离克隆到了马铃薯病程相关蛋白（prpl-1)基因启动子，与国外文献报道序列完全一致。将这一启动子亚克隆到中间载体pUC18中，再构建到植物表达载体pBI121上，以取代其原有的CaMV35S启动子，得到重组植物表达载体pBI121M；用电脉冲法将pBI121M转入农杆菌LBA4404。应用农杆菌介导法，将携带有pBI121M重组质粒的农杆菌转化烟草，经卡那霉素筛选，得到了一批转基因植株。转基因植株的PCR鉴定表明，启动子整合到了烟草植株基因组中。本研究为下一步通过X－Glu染色法检测启动子下GUS基因的表达情况，研究该启动子的病原菌特异性诱导活性，并建立新的植物转基因系统奠定了基础。     

花粉管介导的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白转基因棉花的筛选

利用新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因进行遗传转化是培育新疆棉花抗寒品种的新途径. 研究采用RT-PCR结合RACE技术从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲(Microdera puntip ennis dzungarica)中克隆获得抗冻蛋白(Antifreeze protein)基因Mp AFP149.将MpAFP149克隆至 pBI121上,获得重组质粒后采用电转化法将重组质粒转入农杆菌EHA105内,PCR筛选鉴定重组子,并测序确定抗冻蛋白植物表达载体构建正确.将pBI121-MpAFP通过田间的花粉管导入技术转化棉花,收取转化的棉花种子,经检测证明在转化10 000朵花中,卡那霉素抗性筛选出 13株,PCR检测有2株阳性植株.实验结果为进一步开展抗冻蛋白基因转化棉花的研究奠定了基础.     

甜瓜蔗糖合成酶基因(CmSS1)反义表达载体的构建及遗传转化

以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD18-T-CmSS1和表达载体pBI121,再用T4 DNA连接酶将回收的目的片段反向与pBI121连接。结果证明,CmSS1反向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmSS1的重组质粒;利用农杆菌介导法将反义CmSS1基因转化甜瓜,经PCR检测,得到5株转基因植株。这为以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性调节机制及通过基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基础。     

鹅细小病毒NS1基因植物真核表达载体的构建

根据发表的鹅细小病毒GPV B株全基因组设计一对引物,采用PCR方法扩增出鹅细小病毒扬州株(GPV YZ)非结构蛋白基因NS1,克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞JM109。经菌液PCR、双酶切及质粒PCR鉴定后,将阳性重组质粒转化感受态农杆菌LBA4404。经菌液PCR及质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-NS1,该载体的构建为进一步研究鹅细小病毒NS1基因的分子生物学特性打下良好基础。     

转紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14大豆研究

为获得磷高效利用转基因大豆新材料,构建紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14超表达载体pBI121-GmPAP14与pCAMBIA3301-GmPAP14,通过农杆菌介导子叶节转化技术将2个载体分别转入高产优质大豆品种,并分析了GmPAP14在转基因植株内的表达情况。结果显示,利用PCR和DNA测序分析可检测到转化植株中的目的条带,其中,转入p BI121-GmPAP14载体的保豆3号阳性植株有6株;转入pCAMBIA3301-GmPAP14载体的中豆32有9株,冀豆12有11株,农大豆2号20株。进一步将上述T0植株自交,目前已获得T_1转基因后代;经实时定量PCR检测,部分株系的GmPAP14表达量显著高于野生型对照,说明GmPAP14已整合到大豆基因组,并能够在转录水平正常表达。