猪嗜血支原体诊断方法的比较

[目的]建立猪嗜血支原体的PCR诊断方法,并与常规染色镜检诊断方法进行比较。[方法]对采自新疆阿拉尔垦区的疑似样品分别采用吖啶橙、姬姆萨染色镜检,采用温度法将嗜血支原体从红细胞上解离下来,提取其基因。根据GenBank上发表的猪嗜血支原体16S rRNA基因组序列（U88565）设计1对特异性引物,进行PCR扩增,建立猪嗜血支原体的PCR诊断方法。[结果]比较了3种诊断方法,指出了各自的优劣。所建立的PCR方法为猪嗜血支原体病的快速诊断及流行病学调查提供了新手段。     

猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析（英文）

[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在PK15细胞上增殖,特异性PCR检测可扩增出特异性片段,经PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%~96.8%;与AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ和AF055392属于基因型PCV2a,与PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区PCVAD的防控提供了理论依据。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a(+)多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%~99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。     

猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析

[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对 PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过 PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株 PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在 PK15细胞上增殖,特异性 PCR检测可扩增出特异性片段,经 PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其 TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%～96.8%;与 AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ 和AF055392属于基因型 PCV2a,与 PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区 PCVAD的防控提供了理论依据。     

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

[目的]克隆鹅副粘病毒GX1株HN基因与F基因,并进行序列分析。[方法]根据Genbank已发表的鹅副粘病毒GPV-SF02株基因组核苷酸序列设计2对引物,对从广西发病鹅分离到的鹅副粘病毒毒GX1株的HN和F基因进行PCR扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。[结果]该株副粘病毒株的HN基因和F基因核苷酸序列全长分别为1 716和1 662 bp,与GPV-SF02株的同源性均在97.3%左右,与LaSota株、F48E9株、JS株的同源性为80.3%~97.5%,与M iyadera株的同源性仅84.8%。[结论]分离株GX1株与禽Ⅰ型副粘病毒(A PMV-1)强毒株特征相符,属于A PMV-1基因Ⅶ型。     

猪附红细胞体PCR诊断方法的建立

据猪附红细胞体重庆株16S rRNA基因的序列特点设计合成种特异性引物,建立了猪附红细胞体PCR诊断方法.该方法能特异性扩增840 bp的猪附红细胞体16S rRNA基因片段,而对牛温氏附红细胞体、羊附红细胞体、猫血巴尔通氏体CA株、绵羊肺炎支原体、猪肺炎支原体、假单孢茵、大肠杆茵、沙门氏茵、肝片吸虫、葡萄球菌等的基因组DNA没有扩增条带出现.对猪附红细胞体基因组DNA的最小检测量为0.16 fg.通过对30份临床样品的检测,21份猪附红细胞体感染为阳性,其余为阴性.结果表明:建立的PCR诊断方法具有很高的敏感性和特异性,可用于猪附红细胞体的临床诊断和流行病学调查.     

京津冀地区猪圆环病毒3型的全基因组克隆与分析

【目的】监测近期在京津冀地区流行的猪圆环病毒3型毒株及其基因变异情况。【方法】以近期京津冀地区猪圆环病毒3型阳性临床样品为模板，用PCR技术扩增猪圆环病毒3型全基因组片段，随后进行基因克隆、序列测定和序列分析。【结果】PCR扩增、序列测定和BLAST比对结果显示获得4株大小都为2 000个核苷酸的猪圆环病毒3型全基因组序列。基于全基因组核苷酸分析结果显示，这4株猪圆环病毒3型与选取的国内外15株猪圆环病毒3型的同源性均达98.4%以上，系统发育树显示上述PCV3毒株所处的分支虽有所不同但却都非常近，表明不同猪圆环病毒3型毒株之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性和保守性。基于开放阅读框2基因核苷酸的系统发育树显示上述猪圆环病毒3型毒株被分成3个分支，所得4株猪圆环病毒3型分别归属于基因型a与c,并呈现出一定的地域差异。【结论】获得了京津冀地区4株猪圆环病毒3型全基因组序列，虽然它们具有很高的全基因组核苷酸同源性与保守性，但却分属于2种基因型，并呈现出一定的地域差异。     

猪细小病毒YL株序列分析及其 VP2基因原核表达

为对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行分子生物学研究,将该病毒YL株基因组分为4个重叠片段进行PCR扩增,并将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,测定病毒基因组全长序列。另外,应用其中1对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原区域的片段,构建重组质粒pET-VP2,IPTG诱导表达。序列分析结果表明,PPV YL株和国内外PPV分离毒株NS1基因核苷酸同源性为97.8%～99.4%,氨基酸同源性为96.7%～99.5%,与国内外主要毒株VP2基因核苷酸同源性为98.7%～99.7%,氨基酸同源性为97.4%～99.8%。进化树分析表明,PPV YL株与BQ株(EU790641)毒株处在同一分支上,遗传距离最近。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量为56ku,经Western blotting检测具有生物学活性。     

禽多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆与序列分析

提取禽多杀性巴氏杆菌分离株Pm27基因组DNA,参考GenBank中Pm70株ompW基因序列设计引物,应用PCR技术扩增了细菌ompW基因,将扩增片段克隆到pMD18-T载体后测序。生物信息学分析表明,该基因编码区长度为615bp,编码204个氨基酸;氨基酸序列与参考株Pm70 OmpW蛋白的同源性最高,达98%;与睡眠嗜血杆菌的同源性77%,与琥珀酸产生菌的同源性为69.3%,与霍乱弧菌、大肠杆菌、耶尔森菌的同源性为50%左右。OmpW蛋白前21个氨基酸残基为信号肽序列,潜在的糖基化位点位于第122位氨基酸残基。     

绵羊肺炎支原体新疆流行株的分离鉴定及其膜蛋白P80基因序列分析

本研究对新疆沙湾县疑似绵羊肺炎支原体(MO)感染的病料进行病原的分离鉴定,并对分离株进行形态学、生化和分子生物学鉴定。分离鉴定出MO13株,提取MO分离株的基因组,经PCR技术扩增MO分离株膜蛋白P80基因,将扩增序列与Gen Bank中已知的MO法国14811株膜蛋白P80基因序列进行比较。结果表明,该序列核苷酸的同源性为97.11%,推导氨基酸序列的同源性达到98.28%。该基因存在60处碱基突变,其中24处是同义突变,36处为错义突变,表明MO不同地域分离株膜蛋白P80存在一定的遗传变异。     

DNA荧光染色法和培养法在支原体检测中的比较

[目的]为检测支原体寻求一种有效、快速的方法。[方法]分别运用DNA荧光染色法和培养法对原材料、细胞和生物制品中的支原体污染进行检测,并对检测结果进行比较。[结果]DNA荧光染色法能够快速、准确地检测出细胞中支原体的污染;培养法在支原体检测中需要的时间较长,但能有效地对原材料、细胞和生物制品中支原体污染进行检测。[结论]有效地检测支原体应根据待检样品的特性来筛选最合适的方法。     

1株感染肉牛的鲍氏不动杆菌的分离与鉴定

[目的]从疑似患有支原体肺炎肉牛中分离出致病菌,并对其进行鉴定。[方法]从爆发牛支原体肺炎的某牛场病牛肺组织中分离致病菌,并对其进行致病性检测和药敏试验。通过16S rDNA序列测定与系统进化分析,进行病原菌的鉴定。[结果]除分离到牛支原体外,还分离到1株致病性细菌FC-1。该菌革兰氏染色为阴性,球杆状,对大环内酯类药物具有耐药性,对氨基糖苷类及喹诺酮类抗生素敏感。16S rDNA序列测定结果表明该菌为1株鲍氏不动杆菌。[结论]导致牛支原体肺炎的病原除牛支原体外,还可能存在其他病原的混合感染。     

屠宰场猪瘟及猪丹毒检验方法的优化

[目的]探讨用于屠宰场生猪猪瘟、猪丹毒的检验方法。[方法]收集疑似猪丹毒、猪瘟病例,宰前检疫,并观察宰后检验过程中皮肤、体内各器官系统出现的病理变化,用微生物学和血清学检查佐证屠宰检验结果,对检出猪丹毒、猪瘟生猪按规定处理。[结果]从疑似猪丹毒病料中分离到猪丹毒杆菌,且分离株可使小鼠感染死亡;对疑似猪瘟病例30份血清进行血清学检查,阳性率达73.3%。[结论]熟练地掌握猪丹毒、猪瘟病理变化鉴别要点,结合实验室快速检测可以提高不合格生猪的检出率。     

鄂西南山区山羊传染性胸膜肺炎霉形体的药物敏感性试验

[目的]为鄂西南山区山羊传染性胸膜肺炎霉形的临床用药提供参考。[方法]分别测定了盐酸环丙沙星、氧氟沙星、甲磺酸单诺沙星、硫氰酸红霉素、罗红霉素、酒石酸泰乐菌素、富马酸泰妙菌素、盐酸四环素等8种药物对PG3株和Y-eshi-goat株的敏感性及联合用药的敏感作用。[结果]PG3株和Y-eshi-goat株一样对8种药物中的红霉素及泰妙菌素最为敏感,其次是罗红霉素和泰乐菌素,四环素及喹诺酮类药物较不敏感。4种药物的联合药敏试验表明,红霉素与氧氟沙星表现为相加作用,而红霉素与泰乐菌素表现为无关作用。[结论]临床上治疗山羊传染性胸膜肺炎时首选红霉素和泰妙菌素等高敏药物,次选泰乐菌素与罗红霉素等中敏药物。     

新疆白车轴草白粉病病原鉴定

[目的]对新疆阿拉尔地区白车轴草(Trifolium repens)上发生的白粉病进行病原鉴定.[方法]通过观察测量和查阅相关文献进行病原菌形态学鉴定以及分子生物学鉴定.[结果]根据形态观察,附着胞裂瓣形,分生孢子梗直立,无分支,脚胞柱形,直或稍弯曲,上接1～2个细胞,分生孢子单生呈桶-柱形,分生孢子顶端萌发.未发现有性型.病原菌核糖体DNA转录间隔区(ITS)序列与来自Genbank中的8条Erysiphe trifolii序列聚为一支,亲缘关系最紧密,且同源性达到99;.[结论]采自阿拉尔地区白车轴草上的白粉菌为E.trifolii.     

猪瘟与高致病性蓝耳病混合感染的诊断及病原特性分析

[目的]诊断由猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪伪狂犬病毒（PRV）引发的猪疫病,并分析病原。[方法]采集福建某猪场发病猪的组织器官,提取病毒DNA或RNA,PCR检测病毒感染。采用ELISA方法检测CSFV、PRRSV和PRV的感染情况。[结果]测序分析和ELISA结果表明,猪场存在PRRSV、CSFV、PRV3种病毒感染。[结论]该次猪病疫情主要是由CSFV和高致病性PRRSV混合感染引起。     

兔皮肤成纤维细胞的体外培养和NESTED-PCR支原体污染检测

[目的]为动物细胞核移植、转基因操作等提供充足的供体材料。[方法]通过对兔皮肤成纤维细胞的体外原代、传代培养和冷冻复苏,检测支原体污染状况。[结果]结果表明:在含有15%FCS(Fetal Calf Serum)的DMEM中培养的细胞初期生长状态较10%FCS中的细胞长势好,后期则相反。用PCR法对培养至25代的兔皮肤成纤维细胞进行支原体检测,均没有发现支原体污染现象。[结论]PCR法检测细胞培养支原体污染具有灵敏、准确、简便、快速、特异性好的优点。     

猪骨粉乳酸菌发酵条件的研究

[目的]优化猪骨粉乳酸菌的发酵条件。[方法]将新鲜猪骨骨粉进行乳酸菌发酵,分别探讨了不同菌种比例、初始pH、加糖量对发酵效果的影响。在单因素试验的基础上,进行正交试验。[结果]最佳发酵条件确定为:菌种比例1∶2,初始pH 6.5,加糖量为7%。在此发酵条件下,发酵后猪骨粉三氯乙酸氮溶解指数(PTA-SN)和磷钨酸水溶性氮(TCA-NSI)分别为0.625 0和0.873 6。[结论]在最佳发酵条件下猪骨粉的营养价值大幅提升,为猪骨的综合利用开辟了新途径。     

毛霉发酵制备猪血多肽的工艺条件研究

[目的]建立制备猪血多肽的新工艺方法。[方法]利用筛选出的产蛋白酶的毛霉（Mucor）菌株M-16作猪血的发酵菌株,研究该菌株发酵制备猪血多肽的性能。[结果]确定了发酵的工艺条件为温度30℃,通气量150 r/min,接种量5%,发酵时间48 h,猪血蛋白质的水解度最高可达到25.69%。[结论]采用新工艺所得到的猪血多肽滤液血腥味消失,有较明显的香味,达到了应用的基本要求。