鹅副粘病毒HZ株HN蛋白基因的克隆及鉴定

以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出HN基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中.经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并进行序列测定验证.结果表明,该基因由1 716个核苷酸组成,共编码571个氨基酸.与GenBank下载的11株参考毒株的HN基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、GY97等毒株的核苷酸同源性高达97%以上,而与Lasota、F48E9等经典NDV株的同源性在80%～83%之间.说明HZ株与经典NDV株的亲缘关系较远,而与江苏近年来分离的鹅源副粘病毒株的亲缘关系非常近;本试验克隆到的是完整的鹅副粘病毒HN基因.     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株 YG97经 1 0日龄鸡胚增殖后纯化 ,提取病毒基因组 RNA,采用 RT-PCR一次性扩增出与预期设计的 1 .7kb大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入 p GEMR -T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,初步获得了含鹅副粘病毒 F基因的阳性克隆 ,并进行了序列测定。序列分析表明 :扩增的 F基因片段的长度为 1 695bp,共编码553个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为 1 1 2 R-R-Q-K-R-F1 1 7,与 NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性试验结果相符。同源性分析表明 :与国内标准强毒株 F48E9的核苷酸同源性为 86%,与国内外部分发表的其他 NDV毒株的核苷酸同源性在 84 %～ 89%之间 ,说明该毒株相对于经典的 NDV在 F基因上已发生了较大的变异     

鹅副粘病毒QY分离株的蚀斑纯化及F基因的克隆与序列分析

将鹅副粘病毒QY分离株蚀斑纯化后,根据已发表的鹅副粘病毒SF02株全基因序列,分别设计合成3对引物,设计合成F基因引物,经RT-PCR方法扩增,克隆入PMD18-T载体,鉴定、测序。测序后拼接得出F基因的全序列长度为1662kb,编码553个氨基酸残基,与GenBank下载的几株参考毒株比较F基因编码区的核苷酸序列,发现所测QY株F基因核苷酸序列同源性与参考毒株SF02为98．3％,与LaSota分别为82．4％,同源性分析表明分离株QY与国内的强毒株参考毒株的同源性较高。     

白鹭源禽Ⅰ型副粘病毒L基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒GPV-SF02株全基因组序列设计5对引物,采用RT-PCR扩增出白鹭源禽Ⅰ型副粘病毒(W13株)L基因的LA(1121 bp)、LB(1481 bp)、LC(1439 bp)、LD(1476 bp)、LE(1608 bp)5个片段,用DNA Star软件比铰分析后进行拼接,获得长约6760 bp包含有L基因全长的核苷酸序列,而W13株L基因的mRNA全长为6704 bp、开放阅读框(ORF)为6615个碱基、编码2204个氨基酸.氨基酸同源性分析表明:W13株L基因与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过97.0%;而核苷酸同源性分析表明:W13株L基因与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过93.0%.可见,W13株与鹅源SF02、ZJl、NA-1株及鸡源Guangxi7株的亲缘关系较近.     

鹅副粘病毒LS-1株的分离鉴定及F基因分析

从山东省梁山县疑似鹅副粘病毒感染的病死鹅中分离到1株LS-1病毒株,经血凝和血凝抑制试验,证实该毒株为禽1型副粘病毒.毒力测定结果表明,该病毒对鸡胚平均致死时间(MDT)为39.5 h;1日龄无特定病原体(SPF)鸡脑内接种分离病毒的致病指数(ICPI)为1.76;6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.42.序列测定结果表明LS-1株F基因核苷酸长度为1 653 bp,编码为551个氨基酸,有6个糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe-117,与已公布的强毒株裂解位点的氨基酸序列相符.同源性分析表明,该毒株F基因与目前已公布的鹅副粘病毒F基因核苷酸同源性在87.0%~98.4%之间,推导的氨基酸序列同源性在87.0%~98.5%之间.     

华南地区新城疫病毒WS_(99)株HN基因片断的克隆和序列分析

用RT -PCR一步法扩增了华南地区野毒NDVWS99株的HN基因 890bp片断 ,并对其进行克隆、核苷酸测序及同源性分析 结果表明 :WS99株的HN基因与其他 2 9株NDV的核苷酸同源性在 88.0 %～ 99.8%之间 ,氨基酸同源性在 90 %～ 97%之间 鸡源NDVWS99株与鹅源副粘病毒GPMV株有极高的同源性 ,高达 99.8% 该毒株与TEX/ 48和B1/ 47一样 ,在HN基因 130 1bp处由G突变为A ,对应氨基酸由V突变为I,但其半胱氨酸位点和个数没有改变 ,且所克隆的目的片段中含有HN基因上 5个凝血抗原位点其中的 4个     

广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

[目的]了解广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的流行特征、毒力强弱及基因类型,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础.[方法]采集疑似发病猪组织病料,通过鸡胚接种传代分离病毒后,分别进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、平均死亡时间(MDT)和脑内接种致死指数(ICPT)测定,然后运用RT-PCR对分离株进行鉴定及扩增部分F基因片段,并对扩增片段进行克隆测序及比对分析.[结果]从广西疑似发病猪组织中分离获得一株猪源禽Ⅰ型副粘病毒,其HA、HI效价均为26,鸡胚最小致死量为10-8/0.1mL,MDT为60 h,ICPI为1.45;分离株F基因112~117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与NDV标准强毒株HER33、F48E9的裂解位点一致;同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株F48E9、中等毒力代表毒株BeaudetteC的核苷酸同源性分别为86.5%和85.7%,其推导氨基酸同源性分别为90.1%和90.8%.[结论]猪源禽Ⅰ型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅱ型,是传统型毒株,广西地区禽Ⅰ型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势.     

马源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

[目的]了解广西马源Ⅰ型副粘病毒的生物特性,为今后有效防控副粘病毒在不同宿主间传播提供科学依据.[方法]用SPF鸡胚对广西百色疑似病马组织悬浮液进行病原分离培养后,经血清学试验和致病性试验鉴定,再用RT-PCR对分离株F基因进行扩增,并对扩增片段进行测序分析.[结果]分离获得的病毒能使鸡红细胞发生凝集,且这种凝集可被鸡新城疫（ND）标准阳性血清所抑制,HA和HI效价分别为27和210.分离株毒力试验结果显示,鸡胚平均死亡时间（MDT）为72 h,雏鸡脑内接种致死指数（ICPI）为1.48,属中发型毒株.分离株与禽Ⅰ型副粘病毒基因Ⅶ型毒株NDV04-21、TW-96p的核苷酸同源性分别为95.9％和95.1％;基于F基因的遗传分型进化树显示,分离株与NDV04-21、TW-96p处于同一进化树分支,属于禽Ⅰ型副粘病毒基因Ⅶ型;分离株F蛋白112～117裂解位点氨基酸序列与标准强毒株F48E9、HER33的一致,在第112～117位氨基酸序列为3＇-R-R-Q-R-R-F-5＇.[结论]广西马群已有禽Ⅰ型副粘病毒存在,再次证实广西地区禽Ⅰ型副粘病毒宿主范围在不断扩大.     

鸡传染性支气管炎病毒河南分离株S1基因克隆及遗传变异分析

根据GenBank中已发表的传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因,设计并合成了1对引物,采用RT-PCR技术扩增鸡传染性支气管炎病毒河南分离株(HN0501)S1基因,并进行克隆和测序.结果表明,所克隆的片段大小为1739 bp,包含S1基因和部分S2基因,S蛋白切割识别位点序列为RRSRR.序列比较分析发现,IBV HN0501株S1基因与澳大利亚N1株、吉林JAAS株S1基因核苷酸同源性分别为99.6%,99.8%,氨基酸同源性均为99.3%,而与其它支气管炎病毒株核苷酸同源性为66.4%~85.2%.通过IBV S1基因系统进化分析,结果发现HN0501株与N1株、JAAS株的亲缘关系近,而与其它支气管炎病毒株的亲缘关系均较远.进一步证实IBVHN0501株为IBV肾型株.     

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH99V株F基因的克隆和序列分析

从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒,经鉴定该病毒属于Ⅰ型禽副粘病毒,命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板,用RT-PCR一步法扩增出其F基因的cDNA序列,然后将其克隆至pMD18-T载体中,对其进行序列测定。结果表明,所克隆的基因片段长度为1 750 bp,含有1个1 662bp的开放式阅读框架(ORF),编码553个氨基酸。将YH99V株F基因序列和推导的氨基酸序列与国内外新城疫毒株的F基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性分别在82.7%-99.6%,氨基酸序列同源性为87.2%-99.3%。YH99V株在F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与弱毒株在这一区域的序列完全相同,表明为弱毒株。根据F基因的全核苷酸序列,进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株F基因的系统发育树。分析结果显示YH99V株与Lasota等参考毒株同属于基因Ⅱ型,表明它们具有较近的亲缘关系。     

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

1材料与方法 1．1病毒来源鹅副粘病毒分离株GX1株由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存。 1．2试剂及仪器各种PCR反应试剂、PMD-18T载体、胶回收试剂盒、限制性内切酶等均购自宝生物工程（大连）公司。仪器：恒温孵化箱、PCR反应仪、超速离心机、移液器等。     

鹅副粘病毒感染的诊断

[目的]为了确定江苏省某养鹅场2007年春季发生传染病的病因。[方法]从发病鹅群采集病料进行流行病学调查、病原分离鉴定、红血球凝集试验和红血球凝集抑制试验,通过交叉HI试验测定F2代分离株和Lasota毒株的HI效价,并用稀释的F2代感染鸡胚尿囊液分别感染鹅和SPF雏鸡,观察其发病和死亡情况。[结果]通过SPF鸡胚接种与传代从病、死鹅的脑、脾、胰混合病料分离到1株病毒。经HA和HI试验证明该分离株为禽I型副粘病毒。人工感染鸡和鹅试验表明该分离株对鸡和鹅都具有高致病性,同群混饲试验表明该分离株具有很强的传染性,属强毒型NDV。这进一步证实该病毒属禽副粘病毒的新成员,即鹅副粘病毒I型。[结论]该研究为NDV出现了某些新的致病特点以及其对鹅同样具有致病性提供了佐证。     

鹅副粘病毒HN基因在昆虫杆状系统表达及其抗原性鉴定

血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)是鹅副粘病毒诱导体液免疫的重要靶抗原。经pMD18-T-HN阳性质粒扩增了HN基因,亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,并将其与线性化的杆状病毒共转染对数生长期的sf 9细胞,得到重组杆状病毒rBv-HN,试验表明,HN在昆虫细胞中得到表达,且产物具有抗原性。     

白鹭源禽I型副粘病毒L基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒GPV—SF02株全基因组序列设计5对引物,采用RT—PCR扩增出白鹭源禽I型副粘病毒（W13株）L基因的IJA（1121bp）、LB（1481bp）、LC（1439bp）、LD（1476bp）、LE（1608bp）5个片段,用DNAStar软件比较分析后进行拼接,获得长约6760bp包含有L基因全长的核苷酸序列,而W13株L基因的mRNA全长为6704bp、开放阅读框（ORF）为6615个碱基、编码2204个氨基酸。氨基酸同源性分析表明：W13株I基因与鹅源SF02、ZJI、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过97．0％;而核苷酸同源性分析表明：W13株L基因与鹅源SF02、ZJI、NA-1株及鸡源Guangxi7株的同源性均超过93．0％。可见,W13株与鹅源SF02、ZJI、NA-1株及鸡源Guangxi7株的亲缘关系较近。     

禽6型副粘病毒JL-127株的分离与鉴定及其毒力基因序列分析

[目的]研究禽6型副粘病毒生物学特性.[方法]从来自吉林省自然保护区的野鸭拭子中分离出1株禽6型副粘病毒（Avian paramyxovirus type 6,APMV6）,进行了形态学、血清学、生物学和病毒分子生物学鉴定,测定该病毒全基因组序列,并对F和HN毒力基因进行进化分析.[结果]成功分离鉴定出1株APMV6,命名为JL-127,基因组全长为16 236 nt,毒力基因进化结果表明,JL-127株与TW及FE株遗传关系较近,与HK株遗传关系较远.[结论]首次对我国野鸭源APMV6分离株进行全基因组测序,并对其进行遗传进化分析.     

GPMV HN基因于禽痘病毒载体中的构建与表达

本研究利用基因重组技术构建含有鹅副粘病毒主要保护性抗原基因-HN基因和报告基因-LacZ基因的重组禽痘病毒转移载体;利用脂质体介导的方法将所构建的转移载体与禽痘病毒FPV-017共感染鸡胚成纤维(Chicken Embryo Fibroblasts,CEF)细胞,通过蓝白筛选获得重组病毒;间接免疫荧光试验结果显示重组禽痘病毒中HN基因在CEF细胞中获得表达,并且表达产物具有良好的反应原性;为进一步的重组禽痘病毒的免疫保护性的研究奠定基础。     

1株抗肿瘤新城疫病毒的毒力分析

[目的]分析1株抗肿瘤新城疫病毒(NDV)的毒力。[方法]通过传统毒力的测定方法,测定此株NDV的最小致死量的平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及静脉致病指数(IVPI)。通过RT-PCR扩增此株病毒基因组的多个片段,相邻扩增片段之间有部分核酸序列重叠且覆盖完整的融合蛋白(F)基因和血凝素神经氨酸酶(HN)基因的区域,并进行测序。[结果]此株NDV的MDT为105.6h,ICPI约为0.26,IVPI为0。测序结果表明,此株病毒是1株新的NDV,其F蛋白剪切位点为112RRQRRF117。[结论]此株NDV为弱毒株,其F蛋白剪切位点与强毒株一致。除F蛋白剪切位点外,NDV的毒力必然与其他因素相关。