正交设计优化日本落叶松SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对日本落叶松SRAP-PCR反应体系的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶浓度五因素在四个水平上进行优化试验,PCR结果采用统计软件SPSS13.0进行分析,结果表明:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中模板DNA影响最大;筛选得到日本落叶松SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为模板DNA浓度为120ng·20μL-1,dNTPs的浓度为0.15mmol·L-1,引物浓度为0.3μmol·L-1,Mg2+浓度为1.5mmol·L-1,Taq酶浓度为0.SU·2μL-1.这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对日本落叶松遗传多样性的研究奠定基础.     

中国兰SRAP-PCR体系的建立及优化

序列相关扩增多态性(SRAP)是新一代的分子标记技术,尚未在兰花中应用过.本实验运用改进了的CTAB法提取国兰总DNA,并L16(45)正交设计,对影响中国兰PCR反应的4个因素(引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs 浓度、扩增模版)在4个水平上进行优化试验,结果采用DPS软件分析.结果表明,在25 μl总体积中,Taq酶为1个单位的情况下,中国兰SRAP-PCR反应最佳扩增体系为: Mg2+ 2 mmol·L-1、DNA模版100 μg、dNTPs 0.25 mmol·L-1、引物0.3 μmol·L-1.这一优化的SRAP-PCR体系的建立为后续国兰SRAP分析奠定基础.     

枫香树DNA提取及SRAP-PCR反应体系的建立与优化

通过不同处理的枫香树叶片及基因组DNA提取方法的对比,并采用L16(45)正交试验设计,对影响SRAP-PCR反应体系的Mg2+,d NTPs,引物浓度及Taq DNA聚合酶和模板DNA用量等5个因素进行优化,确立枫香树SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明,改良CTAB法提取枫香树基因组DNA的产率和纯度均可满足下游试验需要。SRAP-PCR最优反应体系为:总体积20μL,含1×PCR Buffer,1.5 mmol·L-1Mg2+,0.16mmol·L-1d NTPs,0.5μmol·L-1引物,0.9 U Taq DNA聚合酶和40 ng模板DNA。各因素对反应结果的影响大小顺序为Taq DNA聚合酶量d NTPs浓度Mg2+浓度模板DNA用量引物浓度。运用优化的SRAPPCR反应体系对10个不同居群的枫香树基因组DNA扩增检测,结果均能获得稳定性高、多态性丰富和重复性好的条带图谱。     

沙棘SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的SRAP-PCR反应体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、模板DNA浓度进行了优化.优化后的反应体系为Mg2+3.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶2U/25μL、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、模板DNA 30ng/25μL,反应总体系25 μL.利用此体系从30对引物组合中筛选出17对适合沙棘SRAP-PCR的引物,有助于沙棘的分子标记辅助育种研究.     

黄秋葵SRAP反应体系的优化

通过研究黄秋葵SRAP反应体系中主要因子TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度和DNA模板浓度对扩增结果的影响,建立黄秋葵SRAP-PCR反应的优化体系。根据试验确定黄秋葵SRAP反应体系为20μL,75ng模板DNA,0.4μmol·L-1引物,0.750 mmol·L-1 dNTP,1.5 U Taq DNA聚合酶,2.0mmol·L-1 MgCl2,2.0μL 10×PCR缓冲液。     

利用正交设计优化亚麻SRAP-PCR反应体系

为亚麻分子标记及分子育种提供可靠的理论依据,利用正交试验设计对亚麻SRAP-PCR反应体系中的4因素(模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度)在3个水平上进行正交优化,确立了适合亚麻SRAP-PCR反应的20μL体系:75ng模板DNA、0.75μmol.L-1引物、1.5mmol.L-1 Mg2+、0.40mmol.L-1dNTPs和1.5UTaqDNA聚合酶。     

暗纹东方鲀SRAP-PCR体系的建立与优化

以暗纹东方鲀基因组DNA为材料,利用正交设计L16(45)对影响暗纹东方纯SRAP-PCR反应的5个因素(Mg2、Taq酶、dNTPs、模板DNA、引物)在4个水平上进行正交组合,确立了暗纹东方鲀SRAP反应最佳体系为:20 μL的PCR体系中含有Mg2+ 1.5 mmol·L-1、Taq酶0.5U、模板DNA 75 ng、dNTPs 0.15 mmol·L-1、引物0.2 μmol·L-1.利用30个暗纹东方纯样本对该体系进行验证,结果表明该体系稳定可靠.     

荷花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

以荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)品种‘新红’叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化,并确立了适用于荷花SRAP-PCR的最佳反应体系.结果表明:荷花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应总体积10 μL,包含2.0 mmol ·L-1Mg2+、300 μmol·L-1dNTPs、0.5UTaqDNA聚合酶、4μmol·L-1上下游引物、50 ng DNA及10×PCR Buffer.各因素水平变化对反应体系影响由大到小依次为:TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、DNA.用48个荷花品种对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定性和适应性.     

湖北海棠SRAP-PCR反应体系的优化

对PCR反应中相互影响的三因素采用三水平全组合设计,建立了湖北海棠SRAP-PCR的最佳反应体系:Mg2+2.5 mmol·L-1,Taq酶1.5U,dNTP 0.3 mmol·L-1,引物0.3 μmol·L-1,Buffer1×,DNA模板30ng,反应总体积25 μL.应用该体系对33个湖北海棠样本进行扩增,得到了清晰、多态性丰富的扩增条带,证明该体系稳定可靠,可以在湖北海棠的相关研究中应用.     

苦楝SRAP-PCR反应体系的建立及优化

【目的】应用SRAP技术对苦楝Melia azedarach遗传多样性、种质资源鉴定等开展研究,对苦楝SRAP-PCR体系中的模板DNA、d NTPs、Mg2+、引物和Taq DNA聚合酶5个组分浓度进行优化,建立适合苦楝的SRAP-PCR反应体系.【方法】采用单因素试验对反应体系中的5个因素分别设置8个浓度梯度水平,确定浓度范围后进行L16(45)正交试验设计,并对结果进行打分,确定优化体系.【结果和结论】SRAP对苦楝DNA浓度的要求不高,有一个较宽的浓度适宜范围;d NTPs在0.1~0.2 mmol·L-1范围内,能扩增出条带基本相同的清晰谱带;Mg2+为2.0mmol·L-1左右时扩增条带较清晰且数量多;引物介于0.48~0.64μmol·L-1均能扩增出带型基本保持一致且清晰的谱带;Taq DNA聚合酶在0.50~2.00 U范围内可以得到清晰的带型.根据正交试验设计16个处理的得分,确定优化的反应体系为:模板DNA 30 ng、d NTPs 0.125 mmol·L-1、Mg2+2.25 mmol·L-1、引物0.48μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U,反应总体积25μL.     

二次通用旋转组合设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系

采用二次通用旋转组合设计,对辣椒SRAP反应体系中的Taq酶用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA用量等5个主要因素进行优化。结果表明,筛选出的辣椒最优SRAP-PCR反应体系为Taq聚合酶0.5 U,Mg2+2.3 mmol.L-1,dNTPs 0.2 mmol.L-1,引物0.8μmol.L-1,模板DNA 45 ng,总体积10μL。应用该体系对辣椒18份种质材料进行验证,结果证明该体系可靠稳定。因此,该试验的优化方法和优化体系适用于辣椒SRAP分子标记的研究。     

Establishment and Optimization of SRAP Amplification System in Lonicara caerulea L.

A single factor design was applied to optimize five factors influencing SRAP system, including Taq DNA polymerase, template DNA concentration, dNTPs, primer and Mg2＋, each at four levels. The optimal SRAP-PCR system for Lonicera caerulea L. was 20 ktL SRAP-PCR amplification reaction solution containing 2.0 μL 10×PCR buffer, 1.0 U Taq DNA polymerase, 30 ng template DNA, 0.2 mmol·L-1 dNTPs, 2.0 mmol·L-1 Mg2＋ and 0.2μmol·L-1 primer. The suitable amplification procedure consisted of an initial denaturation at 94℃ for 5 min; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 35℃ for 1 rain, extension at 72℃ for 90 s and in total five cycles; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 50℃ for 1 min, extension at 72℃ for 90 s and in total 35 cycles; extension at 72℃ for 8 rain; preservation at 4℃. The procedures and systems could meet the demand for SRAP amplification of Lonicera caerulea L. and would play an important role in Lonicera caerulea L. germplasm identification and genetic diversity analysis.     

长果种黄麻DNA的提取及SRAP分子标记体系的建立

以宽叶长果和甜麻杂交产生的F2代为材料,研究长果种黄麻DNA的提取方法和SRAP分子标记技术中的主要影响因素(包括模板DNA浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度及上下游引物浓度).最终建立了适于长果种黄麻DNA提取的CTAB法与SRAP-PCR反应体系(25 μL):模板DNA 100 ng,引...     

一串红SRAP标记的建立与品种鉴定

为建立一串红相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记,对引物、dNTP、模板DNA、Taq酶用量及退火温度等因素进行了优化,并用建立的SRAP标记对17个一串红品种进行了鉴定。通过测试,确定了适宜一串红的SRAP-PCR反应体系,反应总体积25 μL,包含PCR缓冲液(含2.0 mmol·L-1 MgCl2),模板DNA 60 ng, dNTP 0.2 mmol·L-1,引物0.4 μmol·L-1,Taq酶1 U。温度梯度试验结果表明,SRAP-PCR对第二阶段的退火温度变化(44～56℃)不敏感。在优化SRAP-PCR体系的基础上,采用44对引物组合对17个一串红品种进行了分析。共筛选到37个多态性引物组合。这些引物组合的多态性信息含量(PIC)为0.215～0.941,平均为0.672;所揭示的基因型数为2～17个, 平均为6.76个。仅用F1/R1这一个引物组合就可以鉴别参试的17个品种,包括形态上非常相近的品种‘神州红’和‘帝王’,表明SRAP对一串红品种具有较强的鉴别能力。     

芫荽RAPD体系优化

以芜萎基因组DNA为模板,对RAPD扩增反应条件进行优化,以期建立适合芜荽的RAPD的最优反应体系,结果表明:PCR扩增体系(总体积20μL)为:模板DNA1.0 ng·μL-1,dNTP 0.45 mmol·L-1,随机引物1.3μmol·L-1,Taq酶0.6 U,Mg2+2.0 mmol·L-1,退火温度39℃,...     

正交设计优化莲雾ISSR-PCR反应体系

以莲雾品种‘农科一号’为试材,采用经改良的CTAB法提取莲雾叶片的DNA,探讨了Mg2+、dNTPs、引物浓度、Taq聚合酶、模板DNA含量对莲雾ISSR-PCR的影响。建立了总体积为25μL的莲雾ISSR-PCR反应体系:Mg2+浓度为3.0mmol.L-1﹑dNTP浓度为0.2mmol.L-1﹑primer浓度为0.4μmol.L-1﹑Taq DNA聚合酶1.5U﹑模板DNA含量为30ng,并含2.0μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)。应用该反应体系对‘农科一号’和‘农科二号’进行ISSR-PCR扩增,共筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化（摘要）

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（45）对小麦SRAP-PCR反应体系中的5因素（Taq聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系影响的大小顺序为：Mg2＋〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP-PCR体系为：在20μl反应体系中,包括10×PCR buffer2.0μl、Mg2＋2.0mmol/L、Taq聚合酶2.0U、dNTPs0.2mmol/L、模板DNA40ng、引物0.6μmol/L。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

山核桃SRAP体系的建立及与RAPD和ISSR标记的比较

以山核桃Carya cathayensis基因组DNA为模板,对聚合酶链式反应（PCR）体系各组分进行了梯度实验,优化出条带清晰、重复性好的相关序列扩增多态性聚合酶链式反应（SRAP-PCR）扩增体系,并筛选了引物。该体系（25.00 μL）为：1 × 缓冲液0.20 mmol·L^－1,脱氧核糖核苷酸（dNTPs）,0.20 μmol·L^－1 引物,2.00 mmol·L^－1镁离子（Mg²⁺）,33.34 nkat Taq DNA 聚合酶,0.80 mg·L^－1基因组DNA（以上均为终浓度）。反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,35 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,5个循环;94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环;72 ℃延伸8 min,4 ℃保存,反应时间比其他体系缩短了一半。从100对引物中筛选出了适用于山核桃的引物15对。在山核桃中,随机扩增多态性DNA（RAPD）,简单序列重复区间（ISSR）,SRAP等3种标记,以SRAP标记每对引物扩增的位点数及每对引物扩增的多态性位点数为多,但SRAP多态性引物的比例、多态性位点比例居于另2种标记之间。在山核桃研究中可以考虑使用SRAP及RAPD标记。图6表4参28     

胡萝卜ISSR反应体系优化的研究

以改良CTAB法提取胡萝卜基因组DNA作为ISSR-PCR模板,通过单因素试验建立了一套适合胡萝卜ISSR-PCR的优化的反应体系,即25μL反应液中含10×buffer2.5μL,2.0mmol.L-1Mg2＋,200μmol·L-1dNTPs,Taq酶1.5U,引物0.5μmol·L-1,DNA模板20ng。PCR扩增程序为：94℃预变性4min,94℃变性40s,48～58℃退火45s,72℃延伸2min,进行35个循环,72℃延伸8min,在16℃保存。应用该优化反应体系筛选出了24条有效引物。