基于全长转录组测序的金乌贼微卫星位点筛选与特征分析

以金乌贼(Sepia esculenta)转录组测序获得的177,951条Unigene为对象,采用Micro Satellite (MISA)软件检测及分析其中的简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)的位点信息。结果显示,在金乌贼转录组中共检测出161,327个SSR位点,分布在64,933条Unigene中,SSR位点发生频率为36.49%,出现频率为90.66%。其中,最主要的重复类型为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占SSR总数的46.00%、39.93%和9.48%。SSR包含的重复基元中,A/T是单核苷酸的优势重复基元,AT/AT和AC/GT是二核苷酸的优势重复基元类型。66,004个重复基元长度≥20 bp,占SSR总数的40.91%,且其中含有低级重复基元(二、三核苷酸重复)的SSR位点数量占优。以上结果表明,金乌贼转录组中SSR位点出现频率较高且类型丰富、多态性潜能较高,研究结果可为更好地开发金乌贼SSR分子标记、种质资源保护利用、遗传多样性评价和分子标记辅助育种等提供参考。     

基于RNA-seq技术的江鳕转录组SSR位点信息分析

为开展江鳕(Lota lota)遗传多样性、系统分化分析,开发有效分子标记,采用转录组测序RNA-seq方法,挖掘江鳕微卫星标记。结果显示:通过聚类、从头组装和拼接,获得Unigene共计106 084条。所有的Unigene中,共识别17 619个SSR位点,包含SSR位点的Unigene序列数量为10 893条,占总Unigene的10.27%。江鳕转录组中SSR含量较为丰富,一至六核苷酸重复类型均存在。其中,单核苷酸重复类型的数量最多(7 102个),占总SSR位点数的40.31%。江鳕转录组SSR位点中,以10次重复次数最多,达2 788个位点,占总SSR位点的15.82%。江鳕转录组SSR的片段长度从10～66 bp均有分布,大部分集中在10～24 bp,占SSR总数的87.24%。     

双须骨舌鱼转录组EST-SSR标记开发与引物筛选

利用MISA软件对双须骨舌鱼(Osteoglossum bicirrhosum)性腺转录组测序获得的188 461条Unigene进行SSR检测,结果在11 917个Unigene中共检测到SSR位点12 578个,其中包含2个及以上SSR位点的Unigene有633个。SSR的发生频率为6.32%,平均分布距离为9 949 bp。在筛选到的SSR位点中,优势重复基序为二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸,其中二核苷酸重复基序数量最多,占总数的50.52%。重复基元类型共216种,其中数量最多的类型为二核苷酸重复AC/GT,占总数的20.66%。从所有筛选出的SSR位点中随机选取50个位点并运用Primer Premier 5.0设计引物,共有25对引物成功扩增出特异性产物,并且均在同科的美丽硬仆骨舌鱼(Scleropages formosus)的三个亚种中通用。结果表明,转录组测序产生的EST序列是开发SSR标记的有效来源,开发所得EST-SSR引物可用于双须骨舌鱼及其近缘物种遗传分析、遗传图谱构建以及分子标记辅助育种等工作中。     

军曹鱼全基因组微卫星特征分析与多态性标记的筛选及应用

为更好地开发军曹鱼(Rachycentron canadum)高多态性微卫星分子标记,本研究基于军曹鱼全基因组测序结果,利用MISA1.0软件对其简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)的位点信息进行检索及分析。结果显示,基因组中共筛选出1~6个核苷酸为重复单元的SSR位点344 820个,其中,以单核苷酸重复序列最多(174 146个),占SSR总数的50.50%;其次为二核苷酸重复和三核苷酸重复序列,分别占SSR总数的30.23%和14.02%。在SSR包含的重复单元中,单核苷酸重复以A/T类型为主,AC/GT是二核苷酸的优势重复单元类型。军曹鱼基因组SSR核心序列重复次数在4~275次范围内波动,单核苷酸SSR重复数为10的最多,二核苷酸SSR重复次数为6的最多。本研究设置长度≥12 bp为筛选高多态性SSR位点的标准,共获得361 684个位点。在上述位点中随机选取100个候选位点进行基因分型检测,利用从中筛选到多态性较高的10个SSR标记分别对北海、陵水、硇洲、徐闻和三亚5个养殖群体进行遗传多样性分析,145尾个体中共检测到69个等位基因,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)平均值分别为0.628、0.706和0.653。相关研究表明,军曹鱼基因组中SSR位点类型较为丰富、多态性潜能较高,从中筛选获得的多态性SSR标记可为军曹鱼分子标记辅助育种、群体遗传多样性评价等研究提供有力支持。     

曼氏无针乌贼转录组微卫星特征分析

本研究基于高通量测序获得的曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)转录组数据,采用MISA(MIcro SAtellite)软件对其简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR)位点进行了高通量发掘。组装并去冗余后,得到127575个Unigene,序列拼接的总长度为103104058 bp。对Unigene序列进行SSR分析,共得到62124个SSR(完整型SSR 36813个),分布在50626条Unigene序列当中,SSR出现频率为48.70%,平均16.6 kb出现1个SSR。微卫星序列主要以二碱基重复类型为主(31227,50.27%),其次为三碱基重复(16230,26.13%)。共发现122种碱基重复基元,在所有重复基元中(AT/AT)n占的比例最高为23.33%,其次为(AAAG/CTTT)n(17.42%)。曼氏无针乌贼SSR(完整型)的平均长度为25.87 bp,微卫星主要为重复长度大于20 bp的长序列,长度大于20 bp的微卫星序列占总数的51%。本研究发现,曼氏无针乌贼微卫星出现的频率和其长度呈极显著负相关(P0.01),相关系数为–0.594。该研究结果为开发高度多态性微卫星引物进行曼氏无针乌贼亲缘关系鉴定、种群遗传多样性和增殖放流效果评估等研究奠定了基础。     

基于转录组测序的圆口铜鱼微卫星标记筛选

分析圆口铜鱼(Coreius guichenoti)的遗传多样性,可为其人工繁殖家系鉴别、分子标记辅助育种及长江上游珍稀特有鱼类的种质资源保护提供理论依据和技术支撑。以室内循环水养殖的圆口铜鱼为研究对象,提取其肝脏RNA,通过Illumina HiSeq~(TM) 2000高通量测序平台进行转录组测序,利用MISA软件对测序获得的unigene进行微卫星(SSR)位点挖掘和特征分析,设计SSR位点引物并进行验证。结果显示,圆口铜鱼转录组测序共获得80 688条unigene,通过查找获得34 155个SSR位点,分布在25 947条序列上,发生率为32.2%。圆口铜鱼SSR中主要重复单元类型为单碱基和二碱基,其中A/T和AC/GT为优势单碱基和二碱基重复单元,占总SSR数量的57.2%和19.7%。SSR重复数在5～60次,其中有40.3%的SSR序列集中在11～15次;SSR序列长度变化显著,单碱基至六碱基重复类型的总体长度在11～101 bp,其中12～35 bp序列长度占78.8%。随机选取50个SSR位点合成引物对9尾圆口铜鱼样本进行PCR扩增验证,可稳定扩增出目的条带的有40对引物,其中16对具有多态性,证明了通过转录组测序开发圆口铜鱼SSR标记的可行性。     

基于转录组测序的圆口铜鱼SSR标记初步筛选及特征分析

分析圆口铜鱼(Coreius guichenoti)的遗传多样性,可为其人工繁殖家系鉴别、分子标记辅助育种及长江上游珍稀特有鱼类的种质资源保护提供理论依据和技术支撑。以室内循环水养殖的圆口铜鱼为研究对象,提取其肝脏RNA,通过Illumina HiSeq? 2000 高通量测序平台进行转录组测序,利用MISA软件对测序获得的unigene进行微卫星（SSR）位点挖掘和特征分析,设计SSR位点引物并进行验证。结果显示,圆口铜鱼转录组测序共获得80 688条 unigene,通过查找获得34 155个SSR位点,分布在25 947条序列上,发生率为32.2%。圆口铜鱼SSR中主要重复单元类型为单碱基和二碱基,其中A/T和AC/GT为优势单碱基和二碱基重复单元,占总SSR数量的57.2%和19.7%。SSR重复数在5~60次,其中有40.3%的SSR序列集中在11~15次;SSR序列长度变化显著,单碱基至六碱基重复类型的总体长度在11~101 bp,其中12~35 bp序列长度占78.8%。随机选取50个SSR位点合成引物对9尾圆口铜鱼样本进行PCR 扩增验证,可稳定扩增出目的条带的有40对引物,其中16对具有多态性,证明了通过转录组测序开发圆口铜鱼SSR标记的可行性。     

长江刀鲚选育群体转录组EST-SSR的分布特征分析

本研究利用MISA软件挖掘长江刀鲚(Coilia ectenes)肌肉和肝脏转录组中的微卫星标记,为刀鲚选育群体的种质资源评估和分子标记辅助育种奠定基础。结果显示,从71869条Unigenes中共获得33896条重复单元长度为1~6碱基的微卫星序列;刀鲚转录组中不同类型微卫星的重复基序具有不同的分布特征,其中,单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复为主要的微卫星重复类型,分别占总微卫星数目的34.94%、49.47%和13.34%;不同微卫星重复类型的优势重复基序亦有所不同,其中,A/T为单核苷酸重复基序的优势重复基序占86.25%,AC/GT为二核苷酸重复基序的为优势重复基序占75.25%,AGG/CCT为三核苷酸重复基序的优势重复基序占28.57%;不同微卫星重复基序核苷酸的数量和重复次数亦有所不同,重复次数伴随着重复单元中核苷酸数量的增加而呈现降低的趋势;从100对四核苷酸重复的SSR引物中筛选获得了16对多态性微卫星标记,并以此为基础,对长江刀鲚选育群体(F3)的遗传学特征进行了初步评估,结果显示,长江刀鲚选育群体F3的平均有效等位基因数(Ne)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和Shannon多样性指数I分别为1.7580、0.3414、0.3977和0.6278。以上结果表明,基于刀鲚转录组数据批量开发微卫星是切实可行的,所开发的多态性微卫星标记能够应用于长江刀鲚选育群体的遗传背景评估和进一步的遗传育种研究。     

基于牙鲆RNA-seq数据中SSR标记的信息分析

通过对牙鲆(Paralichthys olivaceus)进行转录组测序(RNA-seq),利用Micro SAtellite(MISA)软件对1~6个碱基重复、碱基数在10 bp以上的微卫星进行鉴定。结果表明,牙鲆转录组水平上,共发现42 183个SSR位点,分布在26 457条Unigene上,发生频率为27.12%,平均密度为339个/Mbp。获得的SSR一共有216种重复基元,其中二核苷酸重复基元类型数量最多,共有17 570个,占所鉴定SSR总数的41.65%。同时用SPSS statistics 20.0软件对牙鲆转录组SSR的多态性进行了评估。     

凡纳滨对虾EST微卫星标记初步筛选

对161 075条凡纳滨对虾dbEST(database of “Expressed Sequence Tags”)的数据进行SSR序列筛选,搜索参数为二~六核苷酸重复6次以上(包括6次),共获得含SSR的EST序列12 600条,占整个凡纳滨对虾dbEST数据库的7.8%,其中二核苷酸重复10 104条,占总ESTSSR序列的80.2%; 三核苷酸重复2 036条(16.1%),四核苷酸重复336条(2.7%),五核苷酸重复35条(0.3%),六核苷酸重复89条（0.7%）。大部分发现的微卫星序列为完美型(perfect)的重复序列。在二核苷酸所获得的SSR重复单元中,AG/CT是优势重复单元,共分布4 820条,占二核苷酸各重复单元的47.8%;其次是AC/GT重复,共分布3 584条,占二核苷酸各重复单元的35.4%;最后是AT/TA 和CG/GC,分别占二核苷酸各重复单元的16.6%和0.2%。通过对凡纳滨对虾EST序列中SSR位点信息的发掘分析,共设计77对微卫星引物,在10个个体中成功扩增的引物有54对,成功扩增率为70.1%。其中多态性丰富的引物28对,多态率为51.9%。等位基因数为2～5,PCR产物大小为140～600 bp。本研究筛选的ESTSSR标记将为凡纳滨对虾的分子遗传学研究、种质鉴定等提供可靠的工具。     

印尼虎鱼RAD-seq数据中微卫星标记的初步筛选及特征分析

采用RAD-seq(Restriction-site associated DNA sequencing)对印尼虎鱼(Datnioides pulcher)进行简化基因组测序,获得13308 806个高质量干净读长(HQ clean reads),利用SSR搜索软件在所得序列中共检测到26359个SSR位点,由496种重复基序组成,主要分布在三、四、五碱基重复类型中,单碱基重复序列中最多的类型为A/T,二碱基重复序列中以AC/GT和AG/GT重复单元为主,三碱基重复序列中以AGG/CCT、AGC/CTG、AGG/CCT为优势类型;在数量上,二碱基重复类型SSR位点最多(19492个),占总SSR位点的73.95%;除了单核苷酸类型外,SSR基序的重复次数主要集中在4-9之间,多态性SSR数目为2 783个。根据SSR位点两翼序列,利用Primer5.0成功设计出20 066对SSR引物,引物设计成功率为76.13%,依据测序数据中的重复类型和重复数,随机选择100个二至五碱基重复类型SSR在6个虎鱼样本中验证其可用性和多态性,有73对引物通过扩增可获得有效目的片段,其中20个SSR验证为具有多态性。开发所得SSR序列可用于印尼虎鱼及其近缘物种遗传分析、遗传图谱构建以及分子标记辅助育种等工作,同时也证实了利用简化基因组测序技术开发SSR标记和发现样品间具有多态性的SSR标记的可能性。     

文蛤转录组中微卫星位点生物信息分析#br#

采用生物信息学方法分析了文蛤(Meretrix meretrix)转录组中微卫星序列(简单重复序列,simple sequence repeat)的分布规律。结果表明:在文蛤转录组SSR中,单碱基重复序列的数量最多,有3001个;其次为三碱基和四碱基重复序列,分别为2254和2200个;二碱基重复序列1052个;五碱基重复序列332个;六碱基重复序列最少,仅13个。文蛤转录组SSR共包含26种重复基元,其中优势基元为单碱基重复A/T有2809个,其次为三碱基重复AAC/TTG有907个,四碱基和二碱基重复中的AAAC/TTTG和AT/TA分别有588和561个,说明文蛤转录组微卫星位点的分布对A/T具有偏好性。文蛤完整SSR的平均长度为18.34 bp,长度分布在12~20 bp,约占41%。研究结果将为研究文蛤SSR标记开发、群体遗传多样性、遗传连锁图谱、种质资源鉴定和分子遗传育种等后续研究提供基础数据。     

基于转录组测序的兴国红鲤微卫星标记筛选

采用Illumina高通量测序技术,对兴国红鲤(Cyprinus carpio var.singuonensis)垂体和性腺等组织进行转录组测序分析,筛选微卫星标记并分析其组成及特征。结果显示:共获得13 652个微卫星标记,对所得位点进行分类,单核苷酸重复类型占47.86%,二、三、四、五、六核苷酸重复类型所占比例分别为34.43%、16.32%、1.25%、0.12%以及0.02%。随机选取30个SSR位点进行PCR验证,有20对可以扩增出清晰稳定的条带。在24个兴国红鲤个体中对上述位点进行多态性分析,结果表明,具有多态性的微卫星引物为9对。不同位点得到的等位基因范围为2~4,平均等位基因数为3.111 1±0.993 8,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)以及多态信息含量(PIC)平均值分别为0.597 2±0.233 2、0.539 7±0.178 0和0.467 2±0.172 1。9个微卫星位点中,有4个显著偏离哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)(P0.05)。Illumina高通量测序提供了一种直观、高效开发微卫星标记的方法,所选兴国红鲤群体遗传多样性维持较好。     

草鱼全基因组微卫星特征分析与亲子鉴定

为分析草鱼全基因组微卫星特征并开发高多态性微卫星标记亲子鉴定平台,实验利用已发布的草鱼全基因组序列,开发高度多态、准确度高、重复单元在4～6碱基范围的微卫星标记.结果显示,在草鱼900.51 Mb基因组序列中共筛选到微卫星序列677363个,总长度12 835 407 bp,占全基因组长度的1.4254％,平均跨度为1...     

黄姑鱼异质雌核发育子代的遗传分析

为了解黄姑鱼（Nibea albiflora）异质雌核发育子代的基因纯合情况,利用微卫星标记（SSR）和扩增片段长度多态性标记（AFLP）对黄姑鱼异质雌核发育家系进行遗传鉴定和分析。结果显示：（1）雌核发育家系在4个SSR位点和5对AFLP引物组合扩增出的位点均未发现父本特异性等位条带,表明雌核发育体比率为100%。（2）用于遗传分析的7个SSR位点在雌核发育家系和正常交配家系中均未见完全纯合的情况,雌核发育家系7个SSR位点的平均纯合度为0.382,是正常交配家系（0.161）的2.37倍。雌核发育家系各个体的纯合位点数为0~6个,纯合位点所占比例为0~85.7%。（3）5对AFLP引物共扩增出182条清晰的扩增条带,其中有21条父本特异性条带和16条母本特异性条带。16条母本特异性条带中有7个条带在雌核发育家系中显著偏分离（P<0.05）。雌核发育家系和正常交配家系多态性条带比例分别为14.7%和20.3%。（4）雌核发育家系与母本的遗传相似度高于与正常交配家系的遗传相似度,正常交配家系同父本和母本的遗传距离大致相同。研究结果表明,黄姑鱼异质雌核发育二倍体家系的遗传纯合度显著高于正常交配家系,人工诱导雌核发育是促进基因纯合的一个有效途径,它不仅可以加速有利基因的纯合固定,还可以加速有害基因的淘汰,从而有效提高育种效率。     

漠斑牙鲆微卫星标记筛选及美国群体遗传结构分析

采用磁珠富集法筛选适合漠斑牙鲆遗传多样性分析的微卫星分子标记。筛选共获得43条序列,其中完美型26个,占60.5%;非完美型14个,占32.6%;复合型3个,占6.9%。选取其中14对特异性好且扩增效率高的微卫星引物,对采自美国北卡罗来纳州沿海的漠斑牙鲆野生群体和养殖群体进行遗传多样性及遗传结构比较分析。研究结果表明,12对引物的扩增产物具有多态性,其中7个位点为高度多态(PIC>0.5)。两个群体中共检测到90个等位基因。12个多态性微卫星位点在两个群体中的平均观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.36和0.57。9个位点在整个群体中呈现出不同程度的偏离遗传平衡(P<0.05),且偏离平衡的位点均表现为杂合子缺失(Fis>0)。野生群体和养殖群体间的遗传距离为0.1115,群体间的遗传分化微弱(Fst=0.0438)。     

基于转录组数据的银鲴微卫星位点筛选

采用Illumina高通量测序技术对银鲴(Xenocypris argentea)肝脏组织进行转录组测序分析,筛选微卫星标记并进行多态性检验。共获得7 272个微卫星位点。随机选取48个4碱基以上重复类型的SSR位点进行引物设计和PCR验证,有47对可以扩增出清晰稳定的条带。在上述47个位点中随机选择26对在洞庭湖银鲴群体中进行多态性分析,结果表明,具有多态性的微卫星引物为21对。不同多态位点得到的等位基因数范围为3~15,平均基因数为7.29±3.94,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)以及香浓-威尔指数(H)平均值分别为0.532 7±0.211 4、0.613 6±0.196 4、0.564 6±0.198 0和1.302 0±0.577 9。21个微卫星位点中,有6个显著偏离哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)。