牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70的克隆与原核表达重组质粒的构建

为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70(HSP70)基因片段原核重组表达质粒,本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70基因序列(D12692.1),应用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,扩增片段大小为1 692bp,与参考序列的同源性为99%。将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSP70,本试验为进一步研究牛瑟氏泰勒虫HSP70基因佐剂作用、研制基因工程疫苗奠定了基础。     

水禽全产业链研究新动态省

1遗传育种:传统手段与现代技术相结合1.1蛋鸭热休克蛋白90(HSP90)基因多态性及其与产蛋性能的关联性分析根据克隆测序获得的鸭HSP90基因序列设计引物,以浙江省缙云麻鸭为试验材料,采用直接测序的方法检测HSP90基因的多态性,寻找与产蛋性能相关的多态位点,为鸭蛋用性状的分子标记辅助选择提供理论依据。结果在蛋鸭HSP90基因644bp处发现一段长为321bp的内含子序列,并在内含子序列中发现3个突变位点,其中36bp处     

蓝狐多巴胺受体D2基因部分序列的克隆测序

对蓝狐多巴胺受体D2(dopamine receptor,DRD2)基因进行克隆测序,为进一步探讨蓝狐DRD2基因与自咬行为的相关分析及染色体定位提供理论基础。本试验参考狗的DRD2基因序列(GenBank登录号:AF293962.1)设计特异引物,对蓝狐的基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并进行序列的同源性分析。试验获得蓝狐DRD2基因序列819 bp,其序列与家犬的同源性最高,达97%,而在水貂和人及小鼠这些哺乳动物的同源性为85%~91%。本研究成功克隆了蓝狐DRD2基因的部分序列,表明其在物种间具有较高的保守性。     

“军牧1号”猪HSP70基因的克隆及序列分析

从“军牧1号“猪淋巴细胞中提取总RNA进行RT-PCR,将获得的HSP70cDNA克隆进pMD18-T载体,并转化至受体菌DH5α中,对阳性重组子进行DNA序列分析,结果构建的克隆质粒中含有编码HSP70的完整阅读框,它由1926个核苷酸组成,编码641个氨基酸,HSP70多肽相对分子质量为70143,C末端有高度保守的EEVD序列。与其他哺乳动物HSP70基因的同源性在81%～99%。氨基酸序列的同源性在81%～98%。与其他猪种比较,“军牧1号“猪HSP70编码基因有4个核苷酸发生替换,推定的翻译序列有2个氨基酸不同。系统进化树分析表明,“军牧1号“白猪与其他猪种的亲缘关系最近。证实了HSP70基因的高度保守性,并为HSP70的进一步研究和应用奠定了基础。     

胞内劳森氏菌lsaA基因克隆与序列分析

目的:克隆并分析胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis,LI)lsa A基因,为研究该基因提供基础。方法:根据已发表的LI基因组序列,设计2条引物,提取猪回肠黏膜的LI基因组,并用PCR技术扩增lsa A基因,将其克隆、测序,进行序列同源性、蛋白抗原性预测等分析。结果:扩增出与702 bp引物相符的基因片段,与Gen Bank的序列同源性为98.4%,该基因编码的蛋白预计具有良好的抗原性。结论:胞内劳森菌las A基因的成功克隆为增生性肠炎的防控提供研究基础。     

水貂黑素皮质素受体-4基因部分序列的克隆测序

对水貂黑素皮质素受体-4(MC4R)基因进行了克隆和序列分析,以期为进一步开展水貂MC4R基因与其肥胖性状的相关分析及基因定位等研究提供理论基础。首先采用特定引物对水貂MC4R基因进行PCR扩增、克隆和测序,然后用DNAMAN软件拼接MC4R基因全序列,并进行序列的同源性分析。试验获得水貂MC4R基因序列816 bp。水貂MC4R基因序列与同一种属的水獭的同源性最高,达96%,而与犬、狐、大熊猫、河马、野猪、山羊、人及小鼠这些哺乳动物的同源性在89%～95%之间,另外,与贝加尔湖海豹和加州海狮的同源性也较高,均为94%。本研究成功克隆了水貂的MC4R基因,结果表明,其在物种间具有较高的保守性。     

牦牛Hepcidin基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的普通牛Hepcidin基因序列(登录号为XM-589792.3)设计1对特异性引物.采用RT-PCR技术从牦牛肝脏组织总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列并进行测序分析,同时构建Hepcidin蛋白物种进化树.结果显示,经克隆获得牦牛Hepcidin基因322 bp的cDNA序列(GenBank登录号为EU863791),含289 bp的开放阅读框,编码82个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽;预测Hepcidin蛋白分子质量和等电点分别为8.88 ku和9.24;与已知普通牛Hep-cidin序列的同源性达99%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律.本研究为Hepcidin基因cDNA全长克隆及基因功能研究奠定了重要基础.     

禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的克隆和表达

本研究参照GenBank中编码禽源热休克蛋白HSP70、HSP40和核糖体蛋白RL4等的基因序列,分别设计特异性引物,采用RT-PCR扩增HSP70、HSP40和RPL4基因,经双酶切后克隆到真核表达载体pEF1α-Myc,得到重组质粒pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40和pEF1α-Myc-RPL4;将构建好的重组质粒,转染HEK293T细胞后,采用间接免疫荧光和Western-blot技术,对目的蛋白进行验证。结果表明,Myc-HSP70、Myc-HSP40和Myc-RPL4融合蛋白在HEK293T细胞内得到了正确表达。本研究为后续禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的功能研究奠定了基础。     

中国新吉细毛羊LHx2基因cDNA克隆与序列分析

以供试羊皮肤组织中提取的总RNA为模板,根据Gen Bank中登陆的绵羊LHx2基因序列设计引物,通过PCR方法扩增RT-PCR合成的LHx2基因编码区第一链c DNA,回收、纯化反应产物,将目的基因与p MD18-T载体连接、转化,获得阳性重组质粒,成功克隆新吉细毛羊LHx2基因c DNA序列,测序长为1 215 bp。基因同源性分析结果显示各物种间同源性均在80%以上。该基因编码405个氨基酸残基,蛋白同源性分析结果显示各物种间同源性差异较大;蛋白二级结构分析显示LHx2蛋白为疏水性蛋白、柔韧性较高;蛋白结构域分析结果表明克隆的基因较为完整。研究结果为深入研究新吉细毛羊LHx2基因提供理论基础。     

广西水牛的HSP70基因片段克隆及分析

为了进一步阐明水牛HSP70基因在热应激中发挥的作用,研究水牛HSP70基因的多态性,试验以广西沼泽型水牛血样为材料,根据HSP70基因的保守区设计引物,应用RT-PCR方法扩增获得了长度为322 bp的HSP70基因片段,并与GenBank公布的其他HSP70蛋白序列比对同时运用DNAStar分析软件构建HSP70基因的系统发育树。结果表明:克隆得到的HSP70基因片段与牛的HSPA1A蛋白、野牦牛的HSPA70-2蛋白和牛的HSP70a蛋白的同源性分别为98%、95%和92%;广西沼泽型水牛与杂交型水牛聚集成一支,这与牛科动物的实际进化关系吻合。     

Cloning and Homology Analysis of HSP90 Gene of Carassius auratus by Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers

The purpose of this study was to analyze the conservative of heat shock protein 90(HSP90) gene, and provide theoretical data for the new HSP gene by exploring the application of HSP90.Using CODEHOP to design the degenerate primers, cloning Carassius auratus HSP90 sequence by PCR, and then the sequence was cloned into pMD18-T vector to construct clone vector after sequencing.Then sequencing homology were compared by BLAST and phylogenetic tree was constructed.The results showed that the homology was 99% between Carassius auratus and Cyprinus carpio; And the homology was 92% between Carassius auratus and Danio rerio.The degeneracy of primers designed in this study was low, the modification of Tm value was more flexible, and the product had high specificity.The study provided basis guarantee for research of Carassius auratus function genes, and laid the theoretical foundation for the study of heat shock proteins conservative in evolution.     

急性冷应激对阿勒泰羊HSP60、HSP70和HSP90基因mRNA表达的影响

为研究急性冷应激通过影响热休克蛋白含量的变化对阿勒泰羊抗寒性能、生产性能及抗病性能等的影响,试验设置常温组（15 ℃±2 ℃）与冷应激组（-25 ℃±2 ℃）,每组各5只羊,屠宰后分别采集急性冷应激组（冷应激24 h后）和常温组的心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织。采用实时荧光定量PCR技术对HSP60、HSP70和HSP90 mRNA含量变化进行检测,并对HSP60、HSP70和HSP90基因进行同源性分析。结果显示,HSP70和HSP90基因与已有绵羊序列同源性高于99%,而HSP60基因与已有波斯金牛序列同源性高于99%;冷刺激后HSP60基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达较常温组均升高,且在肾脏中的表达量差异极显著（P<0.01）;冷刺激后HSP70基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达较常温组均升高,且在肝脏和肾脏组织中的表达量差异极显著（P<0.01）;冷刺激后HSP90基因在心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织中的表达较常温组均升高,且在肝脏组织中表达量差异显著（P<0.05）,而在脾脏和肾脏组织中的表达量差异极显著（P<0.01）。表明急性冷应激极大程度地刺激了机体的产热机能,通过通路中的产热相关基因的相互调节使其能量代谢发生改变,从而提高细胞生存率,增强机体对环境胁迫的耐受力,能更好地适应环境温度的变化。试验结果为进一步深入研究急性冷应激对阿勒泰羊机体的影响提供一定理论依据。     

目录

为了表达牛环形泰勒虫（Theileria annulata）截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点（pI）为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37 ℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。     

蒙古绵羊Brachyury基因的克隆与生物信息学分析

为了对蒙古绵羊Brachyury基因DNA序列进行研究,试验主要利用PCR技术对蒙古绵羊Brachyury基因序列进行扩增并克隆,首次获得了完整的Brachyury 基因序列。利用NCBI网站上的BLAST功能将测序结果同已发表绵羊Brachyury基因序列进行比对,结果显示同源性高达99%,大部分序列完全一致。将该序列与GenBank数据库中登录的牛、人、大鼠、小鼠、山羊、猴和蝾螈等10个不同物种的Brachyury分子序列进行了比对分析。结果显示,蒙古绵羊Brachyury氨基酸序列与牛Brachyury氨基酸序列同源性最高,为96.30%;最低的则是来源于蝾螈的Brachyury氨基酸序列,仅为58.45%。遗传进化分析进一步证实蒙古绵羊与牛的Brachyury亲缘关系较近,与其他物种则遗传距离较远。此外,序列分析发现蒙古绵羊Brachyury基因高度保守,仅个别碱基发生突变。研究结果表明,蒙古绵羊Brachyury基因序列与其他脊椎动物的Brachyury基因序列也具有高度的保守性。     

Cloning and Sequence Analysis of Mongolian Sheep Brachyury Gene

In order to study Mongolian sheep Brachyury gene DNA sequence, main purpose of this article by using the method of PCR, DNA sequence of Mongolian sheep Brachyury gene cloning and the complete Brachyury gene sequences were obtained for the first time.The sequencing with NCBI BLAST function on the site, comparing the results with the published sequences of sheep Brachyury homology was as high as 99%.We compared these sequences with ten Brachyury genes of human, mouse and other animals in GenBank database.The results showed that the most sequences were identical.Mongolian sheep Brachyury shared a 96.30% amino acid homology with Bos taurus, the highest degree of homology indicated a close genetic relationship, and the Caudata had the lowest homology 58.45%.It could be further confirmed by phylogenetic analysis.Moreover, the results showed that Mongolian sheep Brachyury gene sequence of amino acids and other vertebrates Brachyury gene sequence of amino acids were highly conservative.The research results showed that Mongolian sheep Brachyury gene sequences and other vertebrates Brachyury gene sequences were highly conservative.     

重组猪囊尾蚴热休克蛋白35．6真核质粒的构建及鉴定

为了构建猪囊尾蚴（Cysticercuscellulosae）热休克蛋白的真核表达载体,试验利用PCR技术扩增HSP35．6的基因,将其与增强型绿色荧光蛋白的基因先后连接到pVAXI真核表达载体上,得到pVAXI—HSP35．6-EGFP的重组质粒,经酶切及测序鉴定正确。采用脂质体介导的DNA转染法,将阳性重组质粒转染Vero细胞。转染48h后荧光显微镜下观察到明亮的绿色荧光,说明融合基因可在Vero细胞中高效表达。本研究为进一步研究该蛋白生物学功能奠定了基础。     

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列（登录号：AF130119.1）设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（61.78%）,无规则卷曲次之（20.78%）。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。     

单增李斯特菌llsB基因克隆及序列分析

试验旨在对新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2单增李斯特菌llsB基因进行克隆及生物信息学分析，以期进一步完善单增李斯特菌溶血素S的功能研究。根据GenBank中单增李斯特菌F2365基因全长序列（登录号为：AE017262）设计其特异性引物，利用PCR方法对新疆分离株LM90SB2的llsB基因进行扩增，回收目的基因与pMD19-T载体连接，采用PCR、双酶切鉴定筛选阳性菌并进行测序，对所获序列进行同源性比对及遗传变异分析。结果显示，新疆分离株LM90SB2的llsB基因序列全长为876 bp，共编码291个氨基酸；LM90SB2分离株llsB基因核苷酸序列与10-0809、81-0592、81-0558、02-1792、NTSN、02-1289不同分离株同源性均为100%，与CⅡMS-PH-1、NRRLB-57603株的同源性均为99.9%，与J1816、R2-502株的同源性为44.7%~45.0%。分子进化树显示，LM90SB2菌株llsB基因与血清型为4b的菌株亲缘关系较近，聚类为同一分支。蛋白质二级结构预测表明，LM90SB2 llsB蛋白为亲水性蛋白，无信号肽，不形成跨膜结构。本试验成功克隆了LM90SB2株llsB基因，为深入探讨该基因功能提供全面的理论依据。     

Cloning of Carp Inducible Nitric Oxide Synthase Full-length cDNA and its Differential Expression Analysis in Peripheral Blood Leukocytes

The study was aimed to obtain carp iNOS cDNA full-length sequence, and investigate the changes in peripheral blood leukocyte expression of iNOS in the stimulation of different mitogens.Based on EST sequences of iNOS that obtained from carp normal peripheral blood leukocytes cDNA library, full-length cDNA sequence of carp iNOS was successfully amplified by using gene library screening and rapid-amplification of cDNA 5'ends (5'-RACE) method.Carp peripheral blood leukocytes were divided into control and experimental groups and cultured.The experimental groups were stimulated by LPS (1.0 μg/mL) and ConA (1.0 μg/mL) for 4 and 12 h, respectively.And control groups were in the same cultured conditon time without mitogen stimulated.Real-time PCR was used to detect the expression of iNOS in peripheral blood leukocytes of each group.The results showed that the cDNA fragment was total 3 704 bp containing 74 bp 5'untranslated region (UTR), 246 bp 3'UTR and a 3 384 bp ORF encoding 1 127 amino acids.Sequence homology analysis showed that the amino acid sequence of carp iNOS shared 100% identity with Carassius auratus.After LPS and ConA stimulation, the iNOS expression of peripheral blood leukocytes in the experimental groups were increased, and the expression in the short time stimulation condition (4 h) was higher than the long time (LPS 12 h; ConA 24 h).In conclusion, iNOS expression of peripheral blood leukocytes was raised after LPS and ConA stimulation, suggesting that there were dynamic changes in the inflammation.     

沙葱萤叶甲GdHsp70-2,GdHsp70-3的克隆鉴定与表达谱分析

为明确沙葱萤叶甲Galeruca daurica热激蛋白70 (Heat shock protein 70,Hsp70)基因的序列结构及其系统进化关系,本研究通过PCR技术克隆沙葱萤叶甲Hsp70基因cDNA全长序列与基因组序列,并进行生物信息学与表达谱分析。结果显示,克隆获得了沙葱萤叶甲2条Hsp70基因GdHsp70-2(GenBank登录号：MZ853083)和GdHsp70-3(Genbank登录号：OK585088),基因全长分别为2 410 bp和2 242 bp,各自编码657和646个氨基酸,均含有3个保守的HSP70家族特征序列,预测蛋白三维结构均由N-端ATPase功能域和C-端底物结合功能域所组成;系统发育分析表明GdHSP70-2,GdHSP70-3分别与松墨天牛(Monochamus alternatus)MaltHSC70-1、玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera) DvirHSP70-2的亲缘关系最近;基因组DNA克隆获得GdHsp70-2的两段内含子序列,GdHsp70-3则不含有内含子;表达谱分析结果表明GdHsp...