PRRSV美洲型经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10³拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、高致病性株与疫苗株TJM-F92RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株（LP-PRRSV CH-1a）、高致病性株（HPPRRSV TJ）及疫苗株（HP-PRRSV TJM-F92）的Nsp2基因核苷酸序列,设计2对特异性引物1st和2nd,建立鉴别LP-PRRSV、HP-PRRSV与HP-PRRSV TJM-F92的RT-PCR检测方法。用引物1st对LPPRRSV、HP-PRRSV与HP-PRRSV TJM-F92进行RT-PCR扩增,分别扩增587、497和497 bp的特异性片段;用引物2nd对HP-PRRSV与HP-PRRSV TJM-F92进行RT-PCR扩增,分别扩增1 004和644 bp的特异性片段,结合两步RT-PCR扩增结果可达到区分3者的目的;对RT-PCR的特异性、敏感性、重复性进行评价。结果表明,建立的RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于LP-PRRSV、HP-PRRSV与HP-PRRSV TJM-F92的鉴别诊断。     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。     

高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2) 和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以HP-PRRSV和LP-PRRSV混合物总RNA为反转录模板,建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV的二重RT-PCR检测方法;并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果显示,本试验成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,该方法灵敏度高,最低检出限均为100拷贝/μL;重复性好,特异性强,可特异性地扩增HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒,但对Marc-145细胞和其他8种病原对照扩增不出任何条带;自25份临床疑似PRRSV感染病料中共检测出了21份PRRSV阳性样品,其中HP-PRRSV阳性样品共计20份,LP-PRRSV阳性样品4份。结果表明,本研究成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,可适用于高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒双重液相基因芯片检测方法的建立

为了实现快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)并同步鉴别高致病性PRRSV毒株(HPPRRSV),根据PRRSV囊膜蛋白GP2基因保守序列和HP-PRRSV特有的Nsp2基因区保守序列设计特异扩增引物和杂交探针,通过双重一步法RT-PCR不对称扩增和双重微球杂交反应,建立了双重液相基因芯片方法。对12株PRRSV以及其他12种猪病原体的检测显示,该法能特异性检测12株PRRSV毒株并准确鉴别其中7株HP-PRRSV,与其他病原体无交叉反应;对PRRSV、HP-PRRSV病毒液的检测低限均小于每个反应0.5TCID_(50);其组内、组间检测变异系数均10%;检测55份疑似临床样品并与商品化荧光RTPCR试剂盒比较检测结果,符合率达98.2%(54/55)。研究结果为适应临床快速检测PRRSV提供了一种新的分子生物学检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)协同感染细菌性疾病的分析研究

为了解湖北某养殖场猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行毒株的遗传变异和临床感染情况,试验采集10份疑似PRRS发病仔猪的肺脏、淋巴结等临床样品,应用RT-PCR方法扩增PRRSV的Nsp2部分基因用于定性检测分析,并对扩增的其中2份PRRSV阳性样品进行ORF5基因核苷酸序列测定,结合不同疫苗毒株开展同源性比对分析。为进一步揭示病因,通过多重PCR方法对10份发病猪的肺脏和12份鼻拭子样品进行了相关致病菌的鉴定,并对其中的2株不同病原菌开展药敏试验。结果显示,10份临床样品中有5份检测到美洲型变异PRRSV,病原阳性率为50%。ORF5全基因序列分析表明,2个流行毒株间的核苷酸同源性为99.7%,与以TJM-F92、JXA1-R、HuN4-F112等为代表的高致病性致弱疫苗毒株核苷酸同源性最高,为96.7%~97.0%;与美洲型标准毒株VR2332的同源性分别为87.6%和87.9%;与国内较早分离的经典毒株（CH-1R和R98株）的核苷酸同源性分别为92.9%和87.4%、87.7%。患病猪临床常见感染模式为PRRSV+PM+SS、PRRSV+PM或PRRSV+HPS,2株主要致病菌药敏试验表明,多杀性巴氏杆菌对头孢曲松、阿莫西林等药物高度敏感,猪链球菌对阿莫西林、氨苄西林、阿奇霉素等药物高度敏感。本研究揭示了该场保育猪的发病病原,并从分子水平明确了临床PRRSV与不同疫苗毒株的亲缘关系,为弱毒疫苗的合理选择使用和综合防控PRRS提供了实践依据。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的24株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株和5株PRRSV经典毒株的保守区基因序列,使用PrimerExpress 3.0软件设计并合成实时荧光定量PCR（Real-timeFluorescent Quantitative PCR,Real-time FQ-PCR）用引物和探针,建立了Real-time FQ-PCR检测方法以鉴别检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。用建立的检测方法对已定量的10倍倍比稀释的质粒pGET-258为标准品进行检测,并与常规PCR进行比较。结果显示,该Real-time FQ-PCR方法敏感度可达1.5个拷贝,比常规PCR敏感度高100倍,且批内和批间重复性检测结果的变异系数均小于2%。用该方法与常规PCR方法及病毒分离方法对18份临床样品进行对比检测,显示该方法灵敏度高、成本低,并且能够对样品中病毒进行定量,为高致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断提供了有效的技术手段。     

Establishment of a Duplex Real-time RT-PCR Assay for the Differential Detection of Nipha Virus and Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

To establish a rapid,sensitive and specific assay for the differential detection of Nipah virus (NiV) and highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV),a duplex Real-time RT-PCR was developed with specific primers and probes targeting to the special sequences of NiV M gene and HP-PRRSV nsp2 gene by optimization of reaction conditions.The performance of the assay was linear ranging from 4.6×10¹ to 4.6×10⁷ copies/μL for RNA standard control of NiV M (NiV-M-RNA) and from 4.1×10¹ to 4.1×10⁸ copies/μL for RNA standard control of HP-PRRSV nsp2 (HP-PRRSV-nsp2-RNA),and detection limits of the assay was 46 copies for the NiV-M-RNA and 4.1 copies for the HP-PRRSV-nsp2-RNA,respectively.The coefficients of variation (CVs) of both inter-assay and intra-assay repeatability were less than 2.0%,showing good repeatability.The assay was able to specifically detect NiV and HP-PRRSV simultaneously without cross-reaction with classical swine fever virus (CSFV),porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),swine influenza virus (SIV),porcine parvovirus (PPV),pseudorabies virus (PRV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).Of the 236 samples from pigs for both NiV and HP-PRRSV detection by the established assay,all the samples were negative for NiV,8 samples were HP-PRRSV positive.In conclusion,this assay offers a useful approach for the differential detection of NiV and HP-PRRSV in clinical specimens from the pigs.     

一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒(NiV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSV nsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用.结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSV nsp2基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA),线性范围分别为4.6×10¹~4.6×10⁷和4.1×10¹~4.1×10⁸拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪流感病毒(SIV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)发生交叉反应.用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性.本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段.     

不同PRRS弱毒苗免疫血清对FcγRIIb介导ADE效应的影响

为了研究蓝耳病不同毒株疫苗在ADE效应下的表现,将疫苗血清复合物(用105.0TCID50的HP-PRRSV田间分离株ZJ-2014,与不同弱毒疫苗CH-1R、R98、TJM-F92的免疫血清在不同的稀释梯度下混合作用24 h,获得血清复合物)接种于PAM细胞,进行蓝耳病病毒增殖试验,检测病毒RNA拷贝数。以兔抗猪FcγRIIb血清进行封闭构建对照组,而后接种PAM细胞。通过比较封闭前后PRRS病毒增殖数量的差异,确定不同疫苗血清兔抗猪FcγRIIb多抗对ADE的阻断作用。试验结果表明:TJM-F92株疫苗的血清抗原复合物对ADE效应的阻断效果最为明显,提示在未来蓝耳病疫苗研制及临床应用中,TJMF92株可以成为优选毒株。     

妊娠母猪免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗对仔猪免疫功能的影响

规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）呈持续性感染,给养猪业造成的损失最为严重。部分规模化猪场未实施切实的猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫,呈慢性和潜伏感染,作者现场对妊娠母猪接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）减毒活疫苗（TJM-F92株）,旨在从体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫功能角度探讨妊娠母猪接种疫苗后对仔猪免疫功能的影响。选取妊娠60 d母猪随机分为A、B 2组,A组母猪接种HP-PRRS减毒活疫苗（TJM-F92株）,B组母猪接种等量生理盐水,2组所产仔猪于10、20、30日龄时检测PRRSV、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV） 母源抗体,以MTT法测定外周血T、B淋巴细胞转化率、以琼脂平板法测定血清溶菌酶含量、以Griess试剂法测定NO含量。试验结果表明,妊娠母猪免疫HP-PRRS减毒活疫苗（TJM-F92株）后,其所产10日龄仔猪PRRSV母源抗体水平显著高于对照组仔猪（P＜0.05）,仔猪CSFV阻断抗体极显著增高（P＜0.01）,20日龄仔猪PRV感染抗体显著下降（P＜0.05）;免疫组和对照组所产仔猪的T、B淋巴细胞转化率及NO、溶菌酶含量均无显著差异（P＞0.05）。提示,妊娠母猪免疫HP-PRRS减毒活疫苗（TJM-F92株）,对所产仔猪非特异性免疫功能和T、B免疫功能均无免疫抑制作用,仔猪抗PRRSV母源抗体、抗CSFV阻断抗体均显著增高且PRV感染抗体降低。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

2006-2011年唐山地区猪蓝耳病病毒隐性感染情况调查

为了了解唐山地区猪蓝耳病的带毒情况,采用RT-PCR方法对2006-2011年采自64个县级屠宰场276份商品猪的肺脏或肺门淋巴结进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病原学检测,结果屠宰场阳性率为51.56%,样品总阳性率为20.29%,其中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)样品总阳性率为15.94%,经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)样品总阳性率为4.35%。总之,猪繁殖与呼吸综合征病毒,尤其是高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在唐山地区猪群中污染面积较大,应值得高度重视。     

2012―2013年猪繁殖与呼吸综合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调查

为了解河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行毒株的遗传变异情况和发展趋势。通过RT-PCR方法,对2012―2013年采自河南省各地疑似病料进行PRRSV检测,并对阳性病料进行病毒分离鉴定及分子流行病学分析。结果显示：54份疑似病料中17份检测为阳性,阳性率为31.5%,并分离出3株PRRSV;通过完整的ORF5基因和部分NSP2基因序列遗传进化分析表明,河南地区流行毒株主要为美洲型PRRSV,且17份阳性样品中10份与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）高度同源、2份与经典PRRSV高度同源、另外5份与美洲流行毒株NADC30高度同源,该类毒株的NSP2基因在不同部位存在393个核苷酸缺失,国内尚未见相关报道。结果表明,2012―2013年河南地区PRRSV主要流行毒株为HP-PRRSV,同时出现了新的变异毒株,使河南地区乃至我国PRRSV变异种类更加多样化,提示加强PRRSV流行及变异的监测十分必要。     

鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV）的非结构蛋白2（Nsp2）基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR（Real-time fluorescent quantitative RT-PCR）检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LP-PRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达10¹拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

本试验旨在建立一种快速的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)经典株和变异株的鉴别诊断方法。根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)经典株与变异株Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别诊断PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法;该方法能从经典株与高致病性株PRRSV基因组中分别扩增出549和459 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性;该方法能分别检测出1 pg经典株和0.1 pg变异株RNA含量。建立的RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确、快速鉴别出PRRSV经典株与变异株,将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的鉴别诊断方法。     

对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立与应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的Nsp2基因间的差异,设计3对特异性扩增引物,建立快速检测PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的多重RT-PCR方法。利用PRRSV欧洲株、经典株和高致病性Nsp2变异株及其他相关病毒株进行敏感度和特异性试验。结果显示,所建立的多重RT-PCR对欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的RNA最小检出量分别为0.050 2、0.055 4、0.056 4ng,与CSFV、TGEV、JEV、SIV的核酸均无交叉反应。用该方法检测病料76份,结果PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的阳性率分别为0、7.89%和53.9%,未发现3型病毒间有混合感染的情况。检测结果与单一RT-PCR及RT-PCR检测试剂盒检测结果一致,高于病毒分离。     

河北屠宰场高致病性猪蓝耳病带毒情况调查

为了了解河北省屠宰场猪只高致病性猪蓝耳病的带毒情况,采用RT-PCR方法对2006～2009年采自全省11个地市228个县级屠宰场1565份商品猪的肺脏或肺门淋巴结进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)病原学检测,结果4年间猪场的阳性比率分别为55.56％、72.50％、44.62％和28.74％;4年样品阳性检出率分别为28.45％、40.74％、12.01％和7.31％.HP-PRRSV同伪狂犬病病毒(PRV)、圆环病毒2型(PCV-2)和猪瘟病毒(CSFV)混合感染所占的比率为61.66％,多以PCV-2和PRV的二重或三重混合感染为主.总之,HP-PRRSV在河北省猪群中污染面积较大,值得高度重视.