高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2) 和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以HP-PRRSV和LP-PRRSV混合物总RNA为反转录模板,建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV的二重RT-PCR检测方法;并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果显示,本试验成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,该方法灵敏度高,最低检出限均为100拷贝/μL;重复性好,特异性强,可特异性地扩增HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒,但对Marc-145细胞和其他8种病原对照扩增不出任何条带;自25份临床疑似PRRSV感染病料中共检测出了21份PRRSV阳性样品,其中HP-PRRSV阳性样品共计20份,LP-PRRSV阳性样品4份。结果表明,本研究成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,可适用于高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断。     

PRRSV普通株与变异株鉴别诊断RT-PCR方法的建立与临床应用

通过对GenBank已公布猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）普通株与变异株Nsp2基因序列进行比对分析,设计合成3条引物,建立一步鉴别诊断普通株与变异株PRRSV的RT-PCR检测方法。结果表明,PCR扩增获得的普通株片段大小为267bp,变异株片段大小为180bp。敏感性试验结果表明该方法具有较高的敏感性,能检测到含量为1.5pg的核酸含量;特异性结果表明该方法在同等条件下检测PRV、CSFV、PCV-2、JEV、CPV、TGEV、SIV均为阴性。对2009-2010年送检的100份临床样品进行检测,结果检出26份变异PRRSV,8份普通PRRSV,阳性率为34%;与ELISA抗体检测试剂盒比较,多检出4份阳性样品。表明建立的鉴别诊断PRRSV的RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,适用于临床针对PRRSV的检测。     

鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV）的非结构蛋白2（Nsp2）基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR（Real-time fluorescent quantitative RT-PCR）检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LP-PRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达10¹拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。     

PRRSV美洲型经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10³拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。     

鸡传染性支气管炎疫苗株与广西流行野毒株鉴别方法的建立

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)3′端非编码区和S1基因保守区域设计两对特异性引物,对H120、Ma5和4/91、M41等常用疫苗株以及26株广西田间分离株进行二重RT-PCR扩增,并进行该方法的特异性和敏感性试验,同时进行了初步应用。结果表明,经RT-PCR扩增后,M41毒株得到约160bp的目的片段,Mass型毒株得到约370bp的目的片段,4/91型IBV毒株得到约480bp和345bp 2条目的片段,其他24株广西分离株得到1条大小在260bp~345bp的目的片段。特异性试验表明此二重RT-PCR方法不能扩增NDV、AIV、MDV、IBDV、ALV等,敏感性试验表明最低检测量达到100pg。该方法的临床应用表明,攻毒鸡病料阳性率达90%。研究结果表明了所建立的二重RT-PCR方法可以鉴别IBV疫苗株与广西流行野毒株,且特异性强,敏感度高。     

北美型猪蓝耳病病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立及应用

参考Genbank发表的美洲型猪蓝耳病病毒(porcine reproductive and respiratory syndrone virus,PRRSV)CH-1a(北美型经典PRRSV)、JXA1(北美型HP-PRRSV)等毒株的的主要结构蛋白基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对特异性的北美型PRRSV鉴别检测引物,其对经典PRRSV的扩增片段为511bp,对HP-PRRSV的扩增目片段为421bp。进行了该方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了美洲型PRRSV鉴别RT-PCR检测方法。应用此法对2010年1—12月收集的126份临床样品进行了检测,总体检出率达53.17﹪。结果表明该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于北美型PRRSV的临床发病鉴别检测及流行病学监测等工作。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

本试验旨在建立一种快速的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)经典株和变异株的鉴别诊断方法。根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)经典株与变异株Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别诊断PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法;该方法能从经典株与高致病性株PRRSV基因组中分别扩增出549和459 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性;该方法能分别检测出1 pg经典株和0.1 pg变异株RNA含量。建立的RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确、快速鉴别出PRRSV经典株与变异株,将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的鉴别诊断方法。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒（NDV）基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物，建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示，强毒株可以扩增出442bp的特异性片段和671bp的通用片段，弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR，整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定，该方法最低能检测到100pg的NDV RNA。     

猪流行性腹泻病毒G1/G2型RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

为建立一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)G1型/G2型感染的RT-PCR方法,基于PEDV的S基因和E基因序列分别设计了PEDV的分型引物和鉴别引物,经过敏感性试验、重复性试验等一系列反应条件的优化,成功建立了鉴别PEDV G1/G2型感染的双重RT-PCR方法;通过目的片段的数量来判断PEDV的感染类型,其中,PEDV G1型感染可扩增得到一条目的片段(249bp),G2型感染扩增得到两条目的片段(840bp和249bp)。利用该方法对采自广西不同地区的92份临床样品进行检测,结果显示,阳性样品55份,其中,G2型样品53份,G1型样品2份。结果表明该方法操作简易,具有良好的敏感性和特异性,能快速鉴别PEDV G1/G2型的感染。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性/经典毒株多重RT-PCR方法的建立及应用

为了建立鉴别猪瘟病毒(Classical swine virus,CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)的快速检测方法,根据GenBank中公布的已知序列,设计合成了针对CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV特异性引物。经过引物筛选及对退火温度、引物比例等扩增条件的优化,建立了用2对引物同时检测CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法可同时扩增出287bp的CSFV、374bp的HP-PRRSV和464bp的C-PRRSV目的核苷酸片段,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)等无交叉反应,最低可以检测到11.3pg的CSFV、4.7pg的HP-PRRSV和2.8pg的C-PRRSV总RNA。分别用多重和单项RT-PCR检测了从河北省采集的31份血清或组织样品,其中CSFV、HP-PRRSV、C-PRRSV以及CSFV与HP-PRRSV混合感染的检出率分别为19.4%、22.6%、0%与9.7%,多重与单项RT-PCR的符合率为100%。本试验建立的多重RT-PCR方法可同时鉴别CSFV、HP-PRRSV与C-PRRSV,适于猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测与流行病学调查。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Differential Detection of Classical,Highly Pathogenic and Vaccine Strains of North American Genotype PRRSV

To establish a rapid method for differential detection of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), a multiple RT-PCR assay was established. In this assay, two pairs of primers were designed according to the genomic sequences of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of PRRSV. The assay could only detect PRRSV, but not detect CSFV, FMDV, PRV and PCV2. The detection limit of the method was as little as 1.13×10³ copies/μL of templates. The established assay was successfully used to detect 349 clinical samples and 119 samples were positive for PRRSV, of which 5 samples were positive for classical PRRSV (C-PRRSV), 107 samples for highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) and 7 samples for TJM-F92 vaccine strain (V-PRRSV), while 7 samples were positive for HP-PRRSV and V-PRRSV. The results indicated that the established multiple RT-PCR assay could be used for differential detection and epidemiological investigation of PRRSV.     

PRRSV高致病性毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank中已发表的PRRSV的NSP2基因序列,设计一对特异性引物。针对经典型毒株与高致病性毒株,采用RT-PCR方法扩增,可分别扩增出相应的576bp,486bp的目的片段。从而在检测PRRSV的基础上,进一步区分PRRSV的经典型和高致病性毒株。通过对扩增条件的筛选,成功地建立了猪繁殖与呼吸综合征经典型与高致病性毒株的RT-PCR鉴别诊断方法,且为PRRSV分离株的鉴定分型及NSP2功能研究奠定了基础。     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。     

不同PRRS弱毒苗免疫血清对FcγRIIb介导ADE效应的影响

为了研究蓝耳病不同毒株疫苗在ADE效应下的表现,将疫苗血清复合物(用105.0TCID50的HP-PRRSV田间分离株ZJ-2014,与不同弱毒疫苗CH-1R、R98、TJM-F92的免疫血清在不同的稀释梯度下混合作用24 h,获得血清复合物)接种于PAM细胞,进行蓝耳病病毒增殖试验,检测病毒RNA拷贝数。以兔抗猪FcγRIIb血清进行封闭构建对照组,而后接种PAM细胞。通过比较封闭前后PRRS病毒增殖数量的差异,确定不同疫苗血清兔抗猪FcγRIIb多抗对ADE的阻断作用。试验结果表明:TJM-F92株疫苗的血清抗原复合物对ADE效应的阻断效果最为明显,提示在未来蓝耳病疫苗研制及临床应用中,TJMF92株可以成为优选毒株。     

检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立1种能够应用于临床样本可以同时检测CSFV、PRRSV、JEV 3种RNA病毒感染的多重RT-PCR方法。根据GenBank收录的CSFV、PRRSV、JEV的基因组全序列,选择3种病毒的特异性保守区序列设计了3对特异性引物,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重RT-PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法分别从CSFV、PRRSV、JEV毒株以及3种病毒的混合物中扩增出大小分别为777、451、605bp的3条特异性条带,其他对照组检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法最低检测量分别为14.2、10.0、8.0pg的CSFV、PRRSV、JEV的RNA;初步应用性试验表明,52份疑似病料中PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为46.1%、21.1%和1.92%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为21.1%。CSFV、PRRSV和JEV混合感染阳性率为3.84%。本试验建立的多重RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可以有效检测CSFV、PRRSV和JEV的混合感染。     

妊娠母猪免疫高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗对仔猪免疫功能的影响

规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）呈持续性感染,给养猪业造成的损失最为严重。部分规模化猪场未实施切实的猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫,呈慢性和潜伏感染,作者现场对妊娠母猪接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）减毒活疫苗（TJM-F92株）,旨在从体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫功能角度探讨妊娠母猪接种疫苗后对仔猪免疫功能的影响。选取妊娠60 d母猪随机分为A、B 2组,A组母猪接种HP-PRRS减毒活疫苗（TJM-F92株）,B组母猪接种等量生理盐水,2组所产仔猪于10、20、30日龄时检测PRRSV、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病病毒（PRV） 母源抗体,以MTT法测定外周血T、B淋巴细胞转化率、以琼脂平板法测定血清溶菌酶含量、以Griess试剂法测定NO含量。试验结果表明,妊娠母猪免疫HP-PRRS减毒活疫苗（TJM-F92株）后,其所产10日龄仔猪PRRSV母源抗体水平显著高于对照组仔猪（P＜0.05）,仔猪CSFV阻断抗体极显著增高（P＜0.01）,20日龄仔猪PRV感染抗体显著下降（P＜0.05）;免疫组和对照组所产仔猪的T、B淋巴细胞转化率及NO、溶菌酶含量均无显著差异（P＞0.05）。提示,妊娠母猪免疫HP-PRRS减毒活疫苗（TJM-F92株）,对所产仔猪非特异性免疫功能和T、B免疫功能均无免疫抑制作用,仔猪抗PRRSV母源抗体、抗CSFV阻断抗体均显著增高且PRV感染抗体降低。     

3种猪细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立猪细胞因子SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中3种重要的猪细胞因子即猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、α-干扰素(interferon α,IFN-α)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因.将3种基因克隆至pMD18-T载体上,得到各自阳性克隆质粒,以3种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验.结果表明,当标准品稀释度为1×10¹~1×10⁶ 拷贝/μL时,3种基因的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均≥0.992.熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好.应用建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92株免疫的30日龄猪外周血单核细胞(PBMC)中IL-12、IFN-α和TNF-α表达量进行检测,结果发现,免疫了PRRSV TJM-F92株的猪PBMC细胞内3种细胞因子表达量均极显著升高(P< 0.01).研究结果为IL-12、IFN-α和TNF-α的定量分析提供了技术平台.