2016-2017年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子检测及NSP2、ORF5基因变异分析

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在广东流行毒株的分子遗传变异情况和发展趋势,通过RT-PCR方法,对2016—2017年采自广东省各地906份疑似病料进行PRRSV检测,并对其中9株PRRSV的NSP2和ORF5基因进行测序及遗传变异分析。结果显示,有399份样品被检出为阳性,阳性率达到44%;通过NSP2和ORF5基因序列比对和遗传进化分析,发现广东流行毒株主要为美洲型PRRSV,且全部9株与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)高度同源;其中7株的NSP2蛋白存在与HP-PRRSV相同的1+29个氨基酸的不连续缺失特征;9株GP5蛋白的2个重要抗原相关区域的氨基酸位变化特征与HP-PRRSV一致,与美洲型代表株VR-2332相比变异明显。结果表明,PRRSV在广东流行的情况仍比较严重,当前HP-PRRSV依然是广东的优势病毒株,提示对PRRSV的流行和变异进行持续监测是有必要的,还应加强对其致病机理和新型疫苗研发等的深入研究。     

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株的分子流行病学调查及防控策略

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况和发展趋势,通过RT-PCR方法,对2015年1-8月份采自广西省各规模猪场的疑似样品进行PRRSV检测,并对阳性病料进行基因测序分析。结果显示:84份疑似样品中有40份检测为阳性,阳性率为47.6%,通过完整的ORF5基因序列遗传进化分析表明,广西地区流行毒株主要为美洲型PRRSV,且均与高致病性PRRSV高度同源。广西省各规模猪场毒株与2015年7月份采自广东肇庆某规模猪场的PRRSV分离毒株间的同源性均较低,经序列对比发现,广东肇庆分离毒株与美洲流行毒株NADC 30高度同源。结果表明,广西地区主要流行毒株为美洲型高致病性PRRSV毒株,且与美洲流行毒株NADC30同源性较低,但广东地区已出现美洲流行毒株NADC30,提示广西地区需加强对PRRSV流行及变异的监测,以及采取有效防控策略的必要性。     

2016年-2017年四川省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查

为了解近年来四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异和分子流行病学情况,通过RT-PCR方法,对四川省各地疑似病料进行PRRSV检测,确定获得阳性样本基因型和对GP5基因遗传进化进行分析.结果显示,149份疑似病料中经ORF7片段检测33份为阳性,阳性率为22.15%(95%CI:15.8%~29.7%);通过对NSP2片段的检测,其中有9份为PRRSV高致病性毒株(HP-PRRSV)、5份为PRRSV经典毒株、8份为PRRSV NADC-30样毒株;通过对GP5基因进行扩增和序列测定,得到11株部分的GP5基因序列数据,所获序列与已报道对应核苷酸序列同源性为60.4%~99.8%,推导的氨基酸序列的同源性为74.3%~100%.结果表明,近两年四川地区PRRSV主要流行毒株为HP-PRRSV,同时新的变异毒株NADC30的流行呈上升趋势.四川地区乃至国内各地区的PRRSV基因在逐渐变异,且毒株的流行趋势在转变,提示应加强对PRRSV流行及变异的监测.     

华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因变异分析

为了解2014年和2015年华东部分地区(山东省和福建省)猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的变异情况,试验收集来自华东部分地区猪场的疑似猪繁殖与呼吸综合征样品41份(山东省19份,福建省22份),采用RT-PCR方法分别进行PRRSV、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)检测。对检测出的阳性样品进行PRRSV的分离鉴定和ORF5基因测序,对测得序列进行遗传进化分析和推导氨基酸序列变异分析。结果表明:山东地区PRRSV检出率为74%,其中HP-PRRSV检出率为21%;福建地区PRRSV检出率为56%,其中HP-PRRSV检出率为42%。用Marc-145细胞从疑似猪繁殖与呼吸综合征病料中分离到16株PRRSV,其中10株为福建毒株,6株为山东毒株;测序获得的16株分离株中12株分布于美洲型的4个亚群,4株处于亚群之间的特殊进化位置。16株分离株以点突变为主,未见插入突变,糖基化位点30,44,51 aa处保守,32～35 aa处变异频繁。说明山东和福建地区流行的毒株不断变异,NADC30亚群毒株已经在山东地区出现,福建地区流行毒株仍以高致病毒株为主,但个别毒株已位于特殊进化位置。     

华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

为了解华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株变异情况,本研究以RT-PCR技术对山东、福建发病猪场的41份组织样品进行PRRSV检测和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)相关毒株(HP-PRRSVLike)检测,对阳性样品进行PRRSV分离、ORF5基因测序及变异分析。结果显示,福建、山东样品的阳性率分别为56%、74%;共分离到16个美洲型毒株(福建10株、山东6株),分属于Lineage 8、Lineage 5、Lineage 3、Lineage 1四个谱系,其中以Lineage 8为主。这表明PRRSV流行毒株多样化,跨谱系毒株重组值得警惕。     

安徽地区猪繁殖与呼吸综合征病毒临床感染与流行毒株的监测与分析

为了解和掌握安徽地区猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的感染状况及流行毒株的特征,利用实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒对2017—2018年安徽地区临床表现为呼吸道症状和繁殖障碍的疑似感染PRRSV的病(死)猪以及血清、唾液、精液等样品进行检测,确定PRRSV的阳性检出率以及PRRSV的毒株类型;对于未能确定的毒株,通过对PRRSV ORF5基因和Nsp2部分基因的扩增测序和比对分析进行鉴定。结果显示:安徽16个地市共计416例样品,检出PRRSV的阳性样品为223例,阳性检出率为53.6%;临床上PRRSV感染未呈现区域性和季节性,各年龄段的猪均有,呼吸道症状多见,病料组织和唾液中阳性检出率高;在223份PRRSV阳性样品中,美洲型经典毒株的阳性检出率为19.7%,高致病性PRRSV(HP-PRRSV)为44.8%,PRRSV NADC30-like为13.0%,仅鉴定美洲型毒株未分离出毒株类型(美洲型毒株)为22.4%。结果表明:安徽地区猪群中PRRSV阳性检出率高,感染情况较为严重,目前临床上PRRSV的优势毒株为HP-PRRSV。     

2016-2017年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ORF5基因变异分析

为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株（HP-PRRSV）;3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株（HP-PRRSV）为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒宁夏株ORF5基因遗传进化分析

为了解宁夏地区感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的基因型和遗传变异情况,收集2008~2014年宁夏4个地区临床疑似发病猪的血清和组织,病毒核酸提取后用特异性引物进行RT-PCR扩增、凝胶电泳和测序,鉴定9份阳性样品。并与国内外猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒代表毒株进行序列比和遗传进化分析。结果表明,9个毒株的ORF5基因中7株属于美洲IV型,2株属于美洲I型。说明宁夏流行的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒均属于美洲型,但病毒亚型之间已发生变异,为PRRSV遗传进化分析和疫病防控提供了新的参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病原流行病学调查

为了解山东省鲁北地区猪繁殖与呼吸综合征病原流行状况,从而全方位做好该病的防控工作。2017年全年在鲁北地区的9个县采集295份病料样品,对病料中的PRRSV进行扩增检测,试验结果显示,总平均阳性率为48.4%,PRRSV以单一感染数为主,占阳性样品总数的79.7%),且于CSFV、PCV2和PRV存在不同程度的混合感染。然后对PRRSV阳性病料进行分型检测,结果显示,HP-PRRSV阳性率为48.3%,类NADC30阳性率为39.9%,经典毒株阳性率为7.7%,HP-PRRSV毒株和类NADC30毒株混感的比率为4.2%。从而为鲁北地区更好的开展PRRS的防控工作提供了依据。     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

PRRSV美洲型经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10³拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Differential Detection of Classical,Highly Pathogenic and Vaccine Strains of North American Genotype PRRSV

To establish a rapid method for differential detection of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), a multiple RT-PCR assay was established. In this assay, two pairs of primers were designed according to the genomic sequences of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of PRRSV. The assay could only detect PRRSV, but not detect CSFV, FMDV, PRV and PCV2. The detection limit of the method was as little as 1.13×10³ copies/μL of templates. The established assay was successfully used to detect 349 clinical samples and 119 samples were positive for PRRSV, of which 5 samples were positive for classical PRRSV (C-PRRSV), 107 samples for highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) and 7 samples for TJM-F92 vaccine strain (V-PRRSV), while 7 samples were positive for HP-PRRSV and V-PRRSV. The results indicated that the established multiple RT-PCR assay could be used for differential detection and epidemiological investigation of PRRSV.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)协同感染细菌性疾病的分析研究

为了解湖北某养殖场猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行毒株的遗传变异和临床感染情况,试验采集10份疑似PRRS发病仔猪的肺脏、淋巴结等临床样品,应用RT-PCR方法扩增PRRSV的Nsp2部分基因用于定性检测分析,并对扩增的其中2份PRRSV阳性样品进行ORF5基因核苷酸序列测定,结合不同疫苗毒株开展同源性比对分析。为进一步揭示病因,通过多重PCR方法对10份发病猪的肺脏和12份鼻拭子样品进行了相关致病菌的鉴定,并对其中的2株不同病原菌开展药敏试验。结果显示,10份临床样品中有5份检测到美洲型变异PRRSV,病原阳性率为50%。ORF5全基因序列分析表明,2个流行毒株间的核苷酸同源性为99.7%,与以TJM-F92、JXA1-R、HuN4-F112等为代表的高致病性致弱疫苗毒株核苷酸同源性最高,为96.7%~97.0%;与美洲型标准毒株VR2332的同源性分别为87.6%和87.9%;与国内较早分离的经典毒株（CH-1R和R98株）的核苷酸同源性分别为92.9%和87.4%、87.7%。患病猪临床常见感染模式为PRRSV+PM+SS、PRRSV+PM或PRRSV+HPS,2株主要致病菌药敏试验表明,多杀性巴氏杆菌对头孢曲松、阿莫西林等药物高度敏感,猪链球菌对阿莫西林、氨苄西林、阿奇霉素等药物高度敏感。本研究揭示了该场保育猪的发病病原,并从分子水平明确了临床PRRSV与不同疫苗毒株的亲缘关系,为弱毒疫苗的合理选择使用和综合防控PRRS提供了实践依据。     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。     

一例高致病性猪蓝耳病、猪流行性腹泻混合感染的诊断

2018年11月,湖南郴州某规模化猪场发生2~3日龄仔猪呕吐、腹泻为主的疫情,发病率70%,死亡率80%,为确定引起仔猪腹泻的原因,从发病猪群中采集2头病死猪的小肠、肺脏、淋巴结等组织进行PCR检测及基因测序分析。检测结果显示猪流行性腹泻和猪蓝耳病均为阳性,猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒均为阴性。测序分析显示所检测到的猪蓝耳病病毒与JXA1毒株高度同源,为高致病性毒株,检测到的猪流行性腹泻病毒为变异毒株,隶属于GⅡ-b群。综合分析,引起此次新生仔猪大批死亡系变异猪流行性腹泻病毒混合感染高致病性猪蓝耳病所致。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的诊断

为确诊广东省阳江市某规模化猪场（存栏800头母猪）保育猪发病死亡的原因,本试验对从该发病猪场采集的3份肺脏、肝脏、脾脏临床样品进行细菌学检测及药敏试验,采用PCR/RT-PCR检测临床样品中猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）和猪肺炎支原体等病原。对特异性扩增的3株PRRSV的ORF5基因产物进行序列测定,与VR2332、HuN4、JXA1、CH-1a等代表毒株进行核苷酸序列同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,试验分离鉴定出1株副猪嗜血杆菌（Hps）,对7种临床常用药如阿莫西林、头孢拉定等均有较强的敏感性。同源性比对结果表明,3株PRRSV （LJW1、LJW2和LJW3）ORF5基因核苷酸同源性为99.3%~99.8%,与欧洲型代表毒株Lelystad核苷酸同源性为64.0%~64.2%,与HP-PRRSV毒株JXA1、HuN4、CH-1a和TJ核苷酸同源性较高,分别为99.2%~99.5%、99.0%~99.3%、94.5%~94.9%和98.8%~99.2%;与中国河南和广西分离的HP-PRRSV毒株HeNzm1-16和GXLZ05-2015核苷酸同源性较高,分别为99.3%~99.7%和99.2%~99.7%,与美洲型经典疫苗株MLV、美洲型标准株NC、美洲型经典株VR2332核苷酸同源性较低,分别为88.5%~88.8%、85.2%~85.5%和82.3%~82.6%。PRRSV ORF5基因系统进化树分析表明,3株PRRSV均属于美洲型毒株,与国内HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4和TJ等处于同一分支,亲缘关系较近。本研究揭示了该场保育猪发病病原,并从分子水平上明确了分离的3株PRRSV与不同代表毒株的亲缘关系,为弱毒疫苗的合理选择使用和综合防控PRRSV提供了参考依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GZZJ201711株全基因组序列分析

为了解贵州省毕节地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因变异情况,于2017年从贵州毕节地区某疑似感染PRRSV猪群分离到1株PRRSV,将其命名为GZZJ201711毒株。采用RT-PCR分段扩增出PRRSV GZZJ201711株13个基因片段,分别连接到pMD19-T载体上进行测序,拼接后得到PRRSV GZZJ201711株全基因组长15 322 bp (去除polyA尾),包括5’UTR、ORFla-ORF7、3’UTR。序列分析表明,GZZJ201711株与欧洲型Lelystad virus(LV)株核苷酸同源性为60.3%,与美洲型毒株代表株ATCC VR-2332核苷酸同源性为89.2%,与HP-PRRSV(HUN4、JXA1、TJ)等毒株同源性在98.8%~98.9%之间。GZZJ201711株与高致病性毒株JXA1、HUN4、TJ属于同一小分支,其中与XJu-1、GDHY毒株遗传关系最近。GZZJ201711毒株的NSP2基因有30个氨基酸缺失,与JXA1、HUN4、TJ等HP-PRRSV毒株缺失位置一致。     

2006—2012年鲁豫冀地区15株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF5/Nsp2基因的遗传变异分析

为研究鲁豫冀地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的遗传变异情况,对2006—2012年来自3省区发病猪场的42份样品进行PRRSV分离鉴定,并进行了生物学特性研究和PCR鉴定,结果显示先后分离到15株PRRSV。分别采用RT-PCR扩增其ORF5基因和部分Nsp2基因并测序,与GenBank中68个ORF5序列和40个Nsp2序列的推导氨基酸序列进行比对,遗传变异分析结果表明,15株分离株均属于美洲型毒株,其中13个毒株Nsp2基因推导的氨基酸序列均存在氨基酸的不连续缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列与JXA1株有较高的同源性(95.5%~97.5%);SDDY2007株与疫苗株RespPRRS MLV和VR2332株亲缘关系相近,处于同一个亚群中;而HN25-2009分离株Nsp2基因推导的氨基酸序列有30个氨基酸的特征性缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析结果显示该分离株处于VR2332所在亚群(氨基酸同源性97.5%),具有一定特殊性。本试验结果表明,2006—2012年高致病性PRRSV是鲁豫冀地区的优势流行毒株,且存在疫苗毒株,3省区流行毒株间有一定遗传差异,但无明显地域特征。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1001株和GX1002株全基因组分子特征分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况及分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增2010年PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株基因片段,经克隆、测序、拼接,获得2个分离株的全基因序列。结果显示,不包括Poly(A)尾,GX1001株、GX1002株基因组全长分别为15329和15318 bp。同源性分析结果表明,2个分离株间全基因组核苷酸序列同源性为99.3%,与国内外北美洲型代表毒株间的全基因组核苷酸序列同源性为84.9%~99.5%,与欧洲型代表毒株间的同源性为61.5%~61.9%。序列分析结果表明,2个分离株的NSP2编码区均存在第481和533-561位,共30个氨基酸的不连续缺失,具有PRRSV高致病性变异毒株(HP-PRRSV)的遗传特征,但分别在不同区域出现新的突变、缺失及插入等变异现象。遗传进化分析结果表明,所有美洲型毒株可分为4个亚群,GX1001株和GX1002株均属于以高致病性JXA1株为代表的第4亚群。上述结果表明,本研究获得的PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株均属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异现象。