稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP_2细胞株的建立及其对p65核转位影响的研究

为建立一株稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(NSP_2)的细胞株,本研究通过脂质体2000介导的方法将携带有PRRSV NSP_2基因序列的真核表达载体(pcDNA3.1-5'Flag-Nsp_2)瞬时转染于HEK293细胞,应用G418筛选、间接免疫荧光(IFA)与western blot方法进行鉴定,获得了1株稳定表达NSP_2的阳性细胞株,命名为NSP_2-11C1-HEK293;将TNF-α作用于该细胞株,采用IFA分析稳转细胞内NSP_2对p65入核的影响。IFA结果显示NSP_2主要在细胞浆中围绕细胞核表达,在细胞中的表达率达95%以上;western blot结果显示出现120 ku的蛋白条带,与预期相符。结果表明本研究获得了一株稳定表达NSP_2的阳性细胞株,在该稳转细胞内NSP_2对p65的入核并没有影响,这为进一步研究揭示PRRSV的致病机理奠定基础。     

超市肉制品细菌污染情况调查

根据世界卫生组织报告,全世界每年死于腹泻疾病的人有200万,多数腹泻都是因为食用了被细菌污染的食物。国家卫生计生委办公厅关于2015年全国食物中毒事件情况的通报显示:2015年我国发生食物中毒事件169起,中毒总人数5926人,其中由细菌引起的食物中毒占全年食物中毒总数的53.7%。可见食源性细菌污染已经不容忽视。     

Marc145细胞源EDC3基因的克隆及其生物信息学分析

为获得Marc145细胞源EDC3基因序列,分析其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本试验采用RT-PCR方法从Marc145细胞中扩增EDC3基因,并进行克隆和序列测定;应用DNAStar软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,与参考序列经BLAST比对后分析同源性,并构建系统进化树;利用生物信息学方法对其编码区蛋白进行二级结构、三级结构、B细胞表位、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示,Marc145细胞源EDC3基因长度为1 527bp,共编码507个氨基酸;EDC3基因编码区核苷酸序列与绿猴、猕猴、狒狒、人、倭黑猩猩、马、野猪、虎鲸、绵羊、非洲象和大熊猫的同源性在91.5%~99.2%之间,与非哺乳动物原鸡同源性最低,仅为81.2%;EDC3氨基酸序列与上述物种的同源性在95.3%~99.6%之间,与原鸡的同源性仅为88.8%。系统进化树结果显示,Marc145细胞源EDC3基因与绿猴的亲缘关系最近,其次是灵长类。蛋白结构预测结果表明,EDC3蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,分别为23.38%和47.35%,二级结构与三级结构预测结果相符。该蛋白存在多个B细胞优势抗原表位,无跨膜结构域及信号肽区域。本试验结果可为Marc145细胞源EDC3基因功能的进一步研究提供参考。     

Marc145细胞源EDC3基因的克隆及其生物信息学分析

为获得Marc145细胞源EDC3基因序列,分析其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本试验采用RT-PCR方法从Marc145细胞中扩增EDC3基因,并进行克隆和序列测定;应用DNAStar软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,与参考序列经BLAST比对后分析同源性,并构建系统进化树;利用生物信息学方法对其编码区蛋白进行二级结构、三级结构、B细胞表位、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示,Marc145细胞源EDC3基因长度为1 527 bp,共编码507个氨基酸;EDC3基因编码区核苷酸序列与绿猴、猕猴、狒狒、人、倭黑猩猩、马、野猪、虎鲸、绵羊、非洲象和大熊猫的同源性在91.5%~99.2%之间,与非哺乳动物原鸡同源性最低,仅为81.2%;EDC3氨基酸序列与上述物种的同源性在95.3%~99.6%之间,与原鸡的同源性仅为88.8%。系统进化树结果显示,Marc145细胞源EDC3基因与绿猴的亲缘关系最近,其次是灵长类。蛋白结构预测结果表明,EDC3蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,分别为23.38%和47.35%,二级结构与三级结构预测结果相符。该蛋白存在多个B细胞优势抗原表位,无跨膜结构域及信号肽区域。本试验结果可为Marc145细胞源EDC3基因功能的进一步研究提供参考。     

贵州土鸡中ALV-J、REV和MDV的混合感染

<正>禽白血病、网状内皮组织增生症和马立克病是禽类最为常见的3种肿瘤病,可导致家禽出现严重的免疫抑制,继发感染其他疾病,对养禽业危害巨大。出现混合感染时,疾病的致病力和致肿瘤能力都远大于单一感染,导致的免疫抑制也更为严重。禽白血病由禽C型反转录病毒科的禽白血病病毒(ALV)引起,根据病毒囊膜糖蛋白gp85抗原性的差异,ALV可分为A～J 10个亚群,J亚型禽白血病病毒(ALV-J)是最近较为流行的外源性病毒,可引起鸡的骨髓细胞瘤。禽网状内皮组     

屠宰场猪肉中猪霍乱沙门氏杆菌的分离鉴定及16S rRNA的序列分析

为了了解屠宰场生猪肉被沙门氏杆菌污染的情况,试验对采集的20份生猪肉进行细菌分离培养、选择性培养、生化试验、革兰氏染色、沙门氏杆菌外膜蛋白C(Omp C)基因PCR检测等方法进行鉴定,采用MegAlign软件绘制分离菌16S rRNA遗传进化树。结果表明:从屠宰场生猪肉中分离到一株疑似沙门氏杆菌,命名为GZ-Q1株; GZ-Q1株为革兰氏阴性的短小杆菌;生化试验结果与沙门氏杆菌的生化特性基本相符; Omp C基因PCR检测可见约204 bp的目的条带; GZ-Q1株与猪霍乱菌株(CP007639. 1)的同源性最高,为99. 9%。说明从屠宰场生猪肉中分离的GZ-Q1株为猪霍乱沙门氏杆菌。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株E11105 N基因的序列分析与原核表达

为研究PRRSV N蛋白的结构、功能以及N蛋白在病毒致病中的作用,以临床分离PRRSV毒株E11105为研究对象,采用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物,经RT-PCR扩增出N基因片段,利用相关分子生物学软件对N基因序列进行分析;将N基因克隆连接到pColdⅠ原核表达载体上,经PCR、双酶切鉴定及序列测定后,得到重组质粒pColdⅠ-N,将pColdⅠ-N转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达后用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot验证分析。结果显示,分离株E11105N基因与北美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株Lelystad virus(LV)、中国2006年暴发的高致病性PRRSV代表株JXA1、中国代表株CH-1a的核苷酸序列同源性分别为93.3%、34.7%、99.2%、95.4%,氨基酸序列同源性分别为94.4%、15.3%、94.4%、99.2%;系统进化树显示,E11105株N基因与美洲型代表株VR-2332、中国高致病性JXA1毒株的亲缘关系较近;分离株E11105N基因所编码蛋白不存在跨膜区;二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占20.33%和63.41%;预测该蛋白可能存在5个较为明显的B细胞优势抗原表位。SDS-PAGE蛋白电泳结果表明,重组N蛋白主要存在于菌体沉淀中,分子质量约为16.7ku;Western blot结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单克隆抗体识别,显色后条带约为16.7ku,与SDS-PAGE蛋白电泳的条带大小一致。