无毒基因avrXa3介导的水稻白叶枯病菌在不同水稻品种上的致病适应性分析

水稻白叶枯病菌[Xanthomonas oryzaepv.oryzae(Ishiyama)Dye]是水稻上重要的细菌病害之一,探明无毒基因avrXa3和含不同抗病基因水稻品种间的互作对于制定有效的病害防治措施有着重要的意义。根据无毒基因avrXa3的序列,构建了水稻白叶枯PXO99A菌株缺失5个串联的无毒基因的突变体PXO99△avr。将avrXa3导入PXO99A和PXO99△avr后,得到衍生菌株PXO99A/avrXa3,PXO99△avr/avrXa3,与36个含不同抗病基因的水稻品种进行互作分析。结果显示,导入avrXa3后的菌株在不同的水稻品种上表现出明显的寄生适应性变化。进一步分析证明无毒基因avrXa3在Wase Aikoku 3、IRBB2、IRBB3、IRBB203、IRBB204、IRBB205、IRBB211、IRBB53、IR24、TN-1等11个水稻品种上病斑缩短,表现明显的无毒活性;在IRBB21、IRBB10、IRBB14、IR26、Cas209、Java14这6个品种上病斑明显变长,体现无毒基因的毒性功能。表明无毒基因avrXa3对PXO99A中其他无毒基因的表达有明显的干扰作用,单个效应分子的变化也会使细菌在不同水稻品种上的寄生适应性发生复杂的改变。     

水稻OsCERK2转基因后代的鉴定与分析

为了研究水稻Os CERK2基因的功能,构建了Os CERK2基因过表达和RNAi载体,利用农杆菌介导的遗传转化获得转基因植株,经多代筛选和分子检测,获得了4个超量表达的过表达纯系和2个转录水平下降的RNAi纯系。转基因植株经病原微生物细胞壁成分喷雾处理,采用半定量RT-PCR方法分析转基因植株中病程相关(PR)基因的表达情况,结果发现,诱导后过表达植株中PR基因表达增强,而RNAi植株中表达下降;抗病性鉴定结果表明,过表达转基因植株对白叶枯菌致病小种PXO99的抗性增强,而RNAi植株与野生型差异不显著。结果表明,过量表达Os CERK2基因可能是水稻抗病的有效途径。     

水稻白叶枯病菌avrBs3/PthA家族基因的随机缺失及突变体PX099△avr功能的研究

利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr.PXO99A及其突变体基因组DNA以内切酶BamH Ⅰ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱.进一步以相同探针检测PXO99A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆.众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列.经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同.因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除.将此文库克隆(p5)分别导入PXO99A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因.同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能.     

水稻白叶枯病菌avrBs3/PthA家族基因的随机缺失及突变体PXO99Δavr功能的研究

利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99~A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr。PXO99~A及其突变体基因组DNA以内切酶BamHⅠ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱。进一步以相同探针检测PXO99~A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆。众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列。经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同。因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除。将此文库克隆(p5)分别导入PXO99~A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99~A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因。同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能。     

水稻白叶枯病菌PXO99A无毒基因缺失突变的研究

对同源重组获得的水稻白叶枯病菌PXO99A菌株的无毒基因突变体PXO99△avr进行Southern杂交验证、突变序列分析和致病性测定.结果表明:该突变体缺失了5个无毒基因,同源重组发生在PXO99A全基因组中一个有5个无毒基因串联的位点上;与PXO99A相比,突变体在IRBB10等15个水稻品种上引致的病斑明显缩短,而在IRBB14、IRBB21和IRBB55上的病斑则变长;缺失的5个无毒基因的综合表现为毒性因子功能.推断:在缺失的基因中含有无毒基因avrXa14、avrXa21、avrxa13以及与抗病基因Xa3、Xa4、xa5、Xa10、Xa17亲和互作有关的毒性因子.     

外源水杨酸对水稻苗期生长与防卫相关基因表达的影响

为探究外源水杨酸(SA)对水稻苗期生长与SA相关防卫反应的影响,用不同浓度外源SA喷施苗期日本晴水稻,利用分光光度计测定水稻苗期生长关键指标叶绿素含量,采用qRT-PCR定量分析外源SA对水稻苗期SA合成基因PAL1、SA受体基因NPR1、SA信号途径下游的转录因子WRKY45/WRKY76和防卫基因PR1a/PR1b的表达水平。结果表明,外源SA对上述水稻基因的影响不同,即低浓度SA在一定程度上促进水稻苗期叶绿素积累,并显著影响水稻苗期防卫相关基因的表达水平;高浓度SA抑制叶绿素的积累,影响水稻的正常生长。综合比较结果显示,喷施2.0 mmol·L^-1外源SA对水稻苗期防卫相关基因表达的影响最为有效,该结果为进一步探索外源SA促进水稻苗期生长并提高水稻苗期防卫能力的作用研究奠定基础。     

水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响

[目的]研究水稻白叶枯病菌fkb M基因对其运动性的影响。[方法]采用同源置换方法对水稻白叶枯病菌野生型菌株PXO99A的fkbM基因进行基因敲除,构建突变菌株ΔfkbM_(Xoo),同时构建互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)。通过运动性试验,确定fkbM基因对运动性的影响。[结果]与野生型菌株PXO99~A相比,ΔfkbM_(Xoo)突变体运动性明显减弱,而互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)能基本恢复水稻白叶枯病菌的运动性。[结论]水稻白叶枯病菌fkbM基因突变能减弱水稻白叶枯病菌的运动能力。     

外源茉莉酸对稻瘟病菌引起褐点型坏死斑的水稻防御响应的影响

[目的]解析外源茉莉酸(JA)对JA合成/响应、水杨酸(SA)合成/受体及防御相关基因表达的影响,为进一步揭示JA调控稻瘟病菌侵染引起褐点型坏死斑的水稻抗病作用机制提供基础数据.[方法]以接种稻瘟病菌菌株Y92-66b后形成褐点型坏死斑的地方中抗水稻月亮谷为研究材料,分别利用400μmol/L JA和200μmol/L JA抑制剂(IBU)外源处理接种稻瘟病菌后引起褐点型坏死斑(72 h)的水稻月亮谷,调查水稻稻瘟病症状,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测JA合成/响应、SA合成/受体、防御和蔗糖/果糖合成酶基因的表达.[结果]外源JA有效减轻了水稻稻瘟病症状.同时,JA诱导水稻JA合成基因OsLOX1、OsOPR1、OsOPR7、OsJIMT、OsHPL3和OsAOS2在72 h时上调表达,至96和120 h时,只有OsAOS2、OsOPR7和OsLOX1上调表达,其余3个基因下调表达;外源JA未诱导OsLOX3表达;JA诱导水稻JA响应基因OsCOI1a、OsMYC2、OsJAZ1、OsJAZ9和OsbHLH35在72 h时上调表达,至120 h时,只有OsCOI1a和OsJAZ1上调表达,其余3个基因均下调表达;外源JA未诱导OsCOI1b和JiOsPR10表达.JA诱导SA受体基因OsNPR4在72 h时显著上调表达(P<0.05,下同),96 h时下调表达,至120 h时又上调表达但不显著(P>0.05).JA诱导SA合成相关基因OsPAD4在72 h时显著上调表达,OsEDS1在120 h时显著上调表达.外源JA诱导防御基因OsPR5在72 h时开始上调表达,至96 h时显著上调表达;外源JA未诱导OsPR4a表达.外源JA诱导参与细胞壁合成的蔗糖合成酶基因OsRSUS1和果糖合成酶基因OsFRK-2表达,IBU则加重了水稻稻瘟病症状,同时抑制大部分JA合成/响应、蔗糖/果糖合成酶和防御基因的表达.[结论]外源JA主要通过诱导稻瘟菌引起的褐点型坏死斑的水稻JA合成/响应基因、参与细胞壁合成的蔗糖/果糖合成酶及防御基因表达参与水稻防御响应.     

水稻白叶枯病菌毒性表达的负调控因子PXO_02944的分子鉴定

【目的】水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo）侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用,而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白,是c-di-GMP信号蛋白家族的成员,研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO_02944的基因结构和功能。【方法】根据PXO_02944基因序列信息,以PXO99A基因组DNA为模板,设计引物扩增PXO_02944基因全长,将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析;分别扩增PXO_02944左右臂片段,将其与目的载体pK18mobsacB载体连接,得到质粒pK2944,将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接,获得重组质粒pK2944-GmR,用于构建基因突变体。将PXO_02944全长基因克隆到载体pHM1上,获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO_02944中,即获得互补菌株ΔPXO_02944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定,分析PXO_02944 基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响,并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944;生物信息学分析发现,PXO_02944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域,但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比,虽然PXO_02944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化, 但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强,T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO_02944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

 用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有     

不同遗传背景籼稻Xa23基因品系的白叶枯病抗性筛选和评价

【目的】系统比较分析含Xa23基因的籼稻品系白叶枯病抗性,为白叶枯病抗性育种及水稻白叶枯病防治等提供种子资源,同时为白叶枯病分子抗性育种提供参考。【方法】以14种遗传背景不同且含有Xa23基因的81份籼稻品系为材料,孕穗期采用剪叶接种法接种7种南方稻区白叶枯病生理小种代表菌株（FuJ、YN24、HNA1-4、GDA2、PXO86、GD1358和PXO99）,接种20 d左右当参试材料的病情趋于稳定时,量取病斑长度,鉴定参试材料的抗病性。【结果】供试材料对7株白叶枯病菌菌株的抗感分析结果显示,81份品系中有74份品系对7株白叶枯病菌菌株均为抗病,其中35份品系对所有菌株为高抗;含Xa23基因品系对7株白叶枯病菌菌株的抗性频率大小为:PXO86和YN24（100.0%）>GD1358和HNA1-4（98.8%）>PXO99（96.3%）>GDA2（95.1%）>FuJ（93.8%）;同一遗传背景品系对7株白叶枯病菌菌株病斑长度的变异系数在100.0%以上的有遗传背景为A、B、C、E、F和H类品系对菌株FuJ,遗传背景为A、B、D和E类品系对菌株GDA2,遗传背景为A类品系对菌株GD1358和HNA1-4,遗传背景为A和B类品系对菌株PXO86、PXO99,遗传背景为A、C和E类品系对菌株YN24;对14种遗传背景不同品系白叶枯病抗性的方差分析结果表明,不同来源含Xa23基因的品系与7株白叶枯病菌菌株间病斑长度均无显著差异（P>0.05）;对含Xa23基因的品系在7株白叶枯病菌菌株诱发下的菌斑长度的相关性分析结果表明,菌株GD1358、HNA1-4、PXO86和YN24与对应的其他菌株间呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）正相关。【结论】在白叶枯病抗性研究时选用菌株GD1358、HNA1-4、PXO86和YN24其中1种抗源接种试验材料,即可得到较宽抗谱的抗性材料,提高育种效率。     

苦荞FtCAD-1和FtCAD-2基因克隆及组织表达分析

【目的】克隆苦荞肉桂醇脱氢酶（CAD）基因并分析其组织表达特性,为深入研究CAD基因在苦荞果壳形成中的分子调控机制提供理论依据。【方法】基于苦荞转录组测序结果,从苦荞厚果壳品种云荞1号和薄果壳品种小米荞克隆CAD基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CAD基因在不同果壳厚度类型（厚果壳苦荞和薄果壳苦荞）不同组织的表达情况。【结果】从薄果壳苦荞和厚果壳苦荞中均克隆获得2条苦荞CAD基因,且这2条基因序列在薄果壳苦荞与厚果壳苦荞中均完全一致,命名为FtCAD-1和FtCAD-2。FtCAD-1基因的开放阅读框（ORF）长度为876bp,编码291个氨基酸残基,为疏水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞核和细胞质;FtCAD-2基因的ORF长度为1083bp,编码360个氨基酸残基,为亲水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞质。FtCAD-1和FtCAD-2蛋白均具有CAD蛋白3个典型的保守结构域,且不具有跨膜结构域和信号肽,属于非分泌蛋白。FtCAD-1与数据库目标蛋白2cf5.1.B的结构相似度为74.74%,而FtCAD-2与数据库目标蛋白5z0c.1.A的结构相似度为63.03%。FtCAD-1与拟南芥的第一类CAD蛋白（AtCAD4和AtCAD5）的亲缘关系较近;FtCAD-2与拟南芥的第二类CAD蛋白（AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6等）的亲缘关系较近。FtCAD-1和FtCAD-2基因均在种仁中的相对表达量最高,且厚果壳苦荞与薄果壳苦荞间无显著差异（P>0.05）。FtCAD-1基因在厚果壳苦荞叶、花和果壳中的相对表达量显著（P<0.05,下同）或极显著（P<0.01）高于薄果壳苦荞,尤其是在厚果壳苦荞果壳中相对表达量是薄果壳苦荞的16倍。FtCAD-2基因除了在薄果壳苦荞果壳中相对表达量显著高于厚果壳苦荞外,在其他组织中的相对表达量均表现为厚果壳苦荞高于薄果壳苦荞。【结论】FtCAD-1属于第一类CAD基因,具有明显的组织表达特异性,推测其在苦荞木质素生物合成过程中发挥重要调控作用。     

巴西橡胶树抗坏血酸过氧化酶基因HbAPX的克隆及其对水杨酸的应答

在对橡胶树转录组进行测序的基础上,利用模式植物中抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)基因的氨基酸序列进行比对并设计引物,通过RT-PCR方法扩增巴西橡胶树APX基因的cDNA片段,命名为HbAPX.该片段包含1个858核苷酸的开放阅读框,编码285个氨基酸的多肽.生物信息学分析结果表明...     

水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的克隆及表达分析

利用5′-RACE方法克隆了在水稻与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)互作过程中下调表达的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的全长序列。通过生物信息学方法分析了该基因及编码蛋白质的结构特征,OsCtBP-A由424氨基酸组成,N端具有2-Hacid_dh_C保守结构域,C端具有植物CtBPs家族特有的NLS和PEST基序,氨基酸序列与拟南芥和牵牛花CtBPs同源物的同源性为63%;基因启动子区推测具有ABA和SA应答调控元件。OsCtBP-A基因对不同信号分子应答的RTQ-PCR分析表明,水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ETH)和脱落酸(ABA)处理水稻后均能诱导该基因的转录表达,但诱导能力有所差异,其中ABA诱导活性最强。     

差异显示法克隆水稻抗白叶枯病相关蛋白激酶基因(英文)

利用已知植物的蛋白激酶及抗病基因氨基酸序列,设计含激酶保守功能域的简并引物,运用ｍＲＮＡ差异显示技术显示经病原菌诱导的抗性品系（ＩＲ２６）及感病品系（金刚３０）愈伤组织ｍＲＮＡ表达差异,并对差异片段分子克隆．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果提示克隆片段确受白叶枯病病菌诱导表达且该基因仅在抗性品系ＩＲ２６中存在高水平表达．     

马尾松水通道蛋白PmPIP1基因克隆及在干旱胁迫下的表达分析

克隆马尾松Pinus massoniana水通道蛋白（AQP）,并对其生物信息学与干旱胁迫表达模式进行分析。采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）以及互补脱氧核糖核酸（cDNA）末端快速扩增（RACE）方法克隆马尾松水通道蛋白基因。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析其在干旱胁迫下的响应模式。结果克隆到一个马尾松水通道蛋白基因,命名为PmPIP1（GenBank登录号为KF582038）。此基因cDNA全长序列为1 301 bp,包括867 bp的完整开放阅读框,99 bp 的5末端非翻译区和335 bp 的3末端非翻译区。编码288个氨基酸残基,分子量为30.86 kD,等电点（pI）8.48。PmPIP1与菠菜Spinacia oleracea （2b5fA）水通道蛋白结构相似。PmPIP1含有6个跨膜区,具有膜内在蛋白（MIP）家族信号序列、高等植物高度保守序列HINPAVTFG和2个天门冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（NPA）保守肽段。PmPIP1基因属质膜内在蛋白（PIPs）亚族,与挪威云杉Picea abies水通道蛋白基因亲缘关系最近,同源性达95%。RT-qPCR表明PmPIP1受干旱胁迫诱导表达。马尾松PmPIP1的克隆丰富了植物AQP基因的资料库,同时推测PmPIP1基因可能参与了马尾松干旱胁迫过程。图8表1参39