不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶基因克隆及其原核表达载体构建

参照拟南芥APX基因保守域序列设计引物,扩增出不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的核心片段,结合RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,利用DNAman软件经序列拼接获得1个全长为1 089bp的cDNA序列,该序列包括开放阅读框867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质等电点5.52的相对分子量31 600。APX基因编码的氨基酸序列与拟南芥APX基因编码的氨基酸的同源性为81%。将APX基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白质的表达,SDS-PAGE电泳结果表明,产生了预期大小的重组蛋白。     

荔枝抗坏血酸过氧化物酶cDNA的克隆和分析

[目的]为了对荔枝果皮中克隆的APX基因进行cDNA序列分析。[方法]采用RT-PCR和RACE技术从荔枝果皮中扩增克隆抗坏血酸过氧化物酶基因,利用NCBI的ORFFinder程序分析克隆基因的序列,然后将ORF转换成氨基酸序列,进行BLASTX和BLASTN分析,最后用dnasismax2.6pro软件将荔枝与胡瓜、加杨等8种植物进行APX氨基酸序列配比和进化树分析。[结果]该基因cDNA全长1118bp,含有645bp的ORF,编码214个氨基酸。它编码的氨基酸序列与胡瓜、加杨、龙眼、落花生、豌豆、芸苔、帕拉港橡胶树和紫花苜蓿编码的氨基酸序列的同源性分别为83%、89%、97%、78%、84%、75%、79%和85%。推测该蛋白的分子式为C1946H3249N645O827S142,相对分子质量为53466.5,等电点为5.16,理论推导半衰期大于10h。[结论]该基因的克隆与cDNA序列分析为采后荔枝果皮中抗坏血酸过氧化物酶的基因工程操作奠定了基础。     

胡萝卜抗坏血酸过氧化物酶基因的分离及其对非生物胁迫的响应

[目的]抗坏血酸过氧化物酶(APX)利用抗坏血酸作为电子供体,清除植物中的过氧化物,在植物应对非生物胁迫中起重要作用。本文目的是研究胡萝卜Dc APX基因在抵御逆境胁迫过程中的响应情况。[方法]以胡萝卜‘黑田五寸’为研究材料,克隆获得胡萝卜Dc APX基因(Gen Bank登录号为KR364573),对该基因进行序列分析,并研究其主要非生物胁迫(高温、低温、干旱和盐胁迫)下的基因表达情况。[结果]序列分析表明,胡萝卜Dc APX基因全长753个碱基,编码250个氨基酸,预估其蛋白质相对分子质量为27.76×103,p I值5.65。进化分析表明,胡萝卜Dc APX在进化关系上与同属伞形科的短果茴芹同源性最高。空间结构分析表明,胡萝卜Dc APX的氨基酸二级结构由38.40%的α-螺旋、10.40%的延伸主链和51.20%的随机卷曲构成。胡萝卜Dc APX的氨基酸三级结构由10个α-螺旋和4个β-折叠构成。实时荧光定量PCR结果显示,胡萝卜‘黑田五寸’中Dc APX基因表达具有组织特异性,在叶中表达量最高。[结论]胡萝卜中Dc APX基因可以响应多种非生物逆境胁迫,在胡萝卜非生物逆境胁迫调控过程中起着重要作用。     

番茄APX基因的分离及表达分析

植物体内代谢的不平衡会导致活性氧的大量积累,若未及时清除,细胞将受到严重的氧化伤害。在抗氧化系统中,抗坏血酸过氧化物酶是其中的关键酶,对于保护细胞组分免受活性氧的破坏是至关重要的。本研究利用RTPCR方法从番茄中克隆得到抗坏血酸过氧化物酶基因,命名为LeAPX,序列全长1 412bp,开放阅读框1 266bp,编码421个氨基酸。系统发育树比对表明,LeAPX氨基酸序列与马铃薯、胡麻、烟草的APX序列同源性较高。氨基酸序列分析表明番茄APX和其它植物一样,含有两个保守的功能域。对其启动子序列分析显示,该片段富含HSE、LTR、GT1等响应胁迫的顺式作用元件。定量分析表明,LetAPX基因在叶片中的表达量最高。     

枸杞抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆与表达分析

为探索青海枸杞抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因信息,并对枸杞APX基因进行生物信息学分析以及基因表达研究,通过RT-PCR和RACE方法克隆枸杞APX基因,利用生物信息学软件预测基因结构,采用实时荧光定量PCR方法分析基因表达的变化。结果显示:枸杞APX基因的全长cDNA序列为1 047bp(Genbank No.KX981601),命名为LcAPX基因。该基因含有1个753bp的完整开放阅读框(ORF),编码250个氨基酸,包含亚铁血红素结合位点、底物结合位点和K~+结合位点。枸杞LcAPX与茄科植物的APX蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。LcAPX基因在枸杞的成熟叶中表达量最高,花中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,显示LcAPX在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程起一定作用。     

巴西橡胶树MADS-27基因的克隆与生物信息学分析

以巴西橡胶树花芽为材料,利用RT—PCR技术从总RNA中扩增获得1个MADS基因。eDNA长度1063bp．开放阅读框717bp,编码239个氨基酸．命名为HbMADS-27。在HbMADS-27氨基酸序列中具有1个较强的跨膜区,二级结构分析结果表明其属于混合型蛋白。HbMADS-27在N端前34-50氨基酸区域内为较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对20个MADS蛋白进行系统进化分析,结果发现,巴西橡胶树的HbMADS-27基因与蓖麻的MADS-27基因亲缘关系最近,而与拟南芥MADS-27基因亲缘关系相对较远。     

北方梭囊孔菌漆酶基因DNA片段的克隆与序列分析

根据报道的10几种真菌漆酶氨基酸序列的保守区域设计了一对简并引物,以北方梭囊孔菌总DNA为模板,通过PCR扩增到一个1 201 bp的基因片段.将片段序列在NCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示99个序列,全部为漆酶基因及其类似基因,因而认为克隆到的片段就是北方梭囊孔菌漆酶基因片段.经过与同源性最高的粗毛革孔菌（laccase lcc1）同一区段编码区序列进行ClustalW比较,其中有6个间隔区,确定为内含子区.去除内含子后,推导的氨基酸序列为286个残基.经与其他几种真菌漆酶的氨基酸序列进行ClustalW比对,同源性均在51%以上.      

巴西橡胶树乳管高效表达焦磷酸酶基因的双元表达载体的构建

以巴西橡胶树叶片为材料提取DNA,用特异引物经PCR扩增获得了378 bp的REF启动子片段,该片段序列与NCBI报道的REF序列间的同源性分别是98.68 %和99.47 %。以胶乳为材料提取总RNA,用特异引物经RT-PCR方法获得了2310 bp的V-PPase基因片段,该片段序列与NCBI报道的V-PPase基因序列一致。通过酶切和连接,将克隆的两个片段重组到植物表达载体pCAMBIA1301, pCAMBIA2301和pCAMBIA3301中,构建了分别含有潮霉素磷酸转移酶基因（hpt Ⅱ）、新霉素磷酸转移酶基因（npt Ⅱ）和抗除草剂基因（bar）的三种橡胶树乳管高效表达V-PPase基因的载体pC1301RV、pC2301RV和pC3301RV。然后用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105,为进一步转化橡胶树奠定基础。     

柑橘类植物GPAT基因片段克隆和SNP分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因是与植物抗冷性强弱密切相关的基因。根据已报道的各种植物GPAT基因的氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR技术,分别从琯溪蜜柚、马家柚、莽山野橘等8种柑橘类植物中克隆得到315bp的GPAT基因片段。使用DNA Star5.0软件对8个片段序列进行同源性比较,8个片段的核苷酸同源性高达97.8%,与其它植物GPAT基因核苷酸序列的同源性都在72.5%以上;经过氨基酸序列推导,每个GPAT基因片段分别编码105个氨基酸,8个片段的氨基酸同源性为95.2%,与其它植物GPAT基因的氨基酸序列同源性在68.9%以上。试验克隆所得8种柑橘类植物GPAT基因片段序列存在明显的单核苷酸变异,在14个核苷酸位点存在SNPs(single nucleotide polymorphisms),导致6个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/22.5bp,核苷酸变异度为4.45%,氨基酸变异度为5.71%。采用NJ聚类法对克隆片段的核苷酸序列进行了遗传多样性分析。     

小麦叶片内几个抗冷相关基因cDNA片段的克隆

运用RT-PCR法,从小麦叶片中克隆出SOD、CAT、APX、GR、CBF、GI等几个抗冷相关基因的cDNA片段,序列比对结果显示,这些基因与GenBank上已登录的大麦、小麦、玉米、水稻等相关基因的同源性较高,表明克隆出了上述几个小麦抗冷相关基因,其中的APX和GR为普通小麦中首次报道。     

橡胶HMGR蛋白的生物信息学分析与同源模建

利用生物信息学方法分析了橡胶HMGR蛋白的氨基酸组成、等电点、疏水／亲水区、二级结构等蛋白质性质,并同荔枝、拟南芥和水稻的蛋白进行了对比,并用生物信息学软件对其空间结构进行了模拟,同时对模建结果进行了结构质量的分析与检测。结果表明：该蛋白共有575个氨基酸,等电点为6．44,二级结构中α螺旋占45．91％,β折叠片占13．04％,无规卷曲占35．83％。三维结构检测表明,此模型的结构符合立体化学规则。此外,利用该模型预测了配体SIM和ADP在HMGR结构空间的近似位置,并定位了与SIM和ADP作用的相关残基。     

巴西橡胶树CCaMK基因家族成员的鉴定和表达分析

钙/钙调素依赖型蛋白激酶(CCa MK,calcium-and calmodulin-dependent protein kinase)是一种钙离子结合蛋白,在钙信号传导过程中起重要作用。本研究以已发表的CCa MK序列作为检索序列,对橡胶树和其他5种植物(木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥)的基因组和转录组数据进行全面搜索,鉴定得到6个CCa MK基因,其中包括一个橡胶树CCa MK基因,命名为Hb CCa MK1。序列分析发现:5种植物的CCa MK氨基酸序列同源性较高,为73%~94%。基因结构分析发现,Hb CCa MK1和所分析的其他植物CCa MK一样均,含有6个内含子、1个蛋白激酶结构域和3个EF-hand结构域;从结构和进化上看,Hb CCa MK1和蓖麻、木薯2种植物的CCa MK具有较近的亲缘关系;在表达方面,Hb CCa MK1在橡胶树根中表达丰度最高,其次为树叶和花;另外,Hb CCa MK1的表达还与叶片发育、真菌侵染和低温胁迫有关。     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树转录组数据库进行搜索,并设计引物进行PCR扩增,得到7个橡胶树钙调蛋白基因的c DNA序列,命名为Hb Ca M1-7。序列分析结果发现,Hb Ca M1-7的CDS序列均为450 bp,编码149个氨基酸,分子量为16.8 ku,等电点为3.95。其中,Hb Ca M1-6间氨基酸同源性为100%,Hb Ca M7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面,Hb Ca M1-7均为一个内含子,且内含子的插入位置相同,但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出,钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面,Hb Ca M1-6在各组织中均有表达,除了Hb Ca M3在根中表达丰度相对较高,其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高,而Hb Ca M7在各组织中的表达均比较低;乙烯利处理后,Hb Ca M2-7的表达均有一定的上升趋势,而在叶片发育过程中Hb Ca M1-5碷呈明显下调表达。由此可见,橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。     

ABC转运蛋白与巴西橡胶树产胶代谢

ABC转运蛋白（ATPBindingCassettetransporter）是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族之一。大多数ABC转运蛋白都能利用水解ATP释放的能量直接转运底物。许多研究结果显示,植物ABC转运蛋白在各种代谢产物的跨膜转运中起着重要作用。橡胶的产胶代谢是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢．是影响橡胶产量的首要因素。相关实验结果显示,ABC转运蛋白可能参与橡胶树产胶代谢。本文介绍了模式植物拟南芥中的ABC转运蛋白研究进展,并对ABC转运蛋白与橡胶树产胶代谢的关系进行讨论。     

巴西橡胶NBS—LRR抗病基因类似物多样性分析

【目的】克隆巴西橡胶抗病基因同源序列,为巴西橡胶抗病R基因的获取奠定基础。【方法】根据已知抗病基因（Resistance gene, R gene）编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计一对简并引物 P1/P2,采集经水杨酸（SA）处理0、12、24、48 h的巴西橡胶叶片,进行cDNA同源序列克隆。【结果】序列分析结果表明,克隆获得的RGAs经系统进化分析分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR 两种类型和9个基因家族;多重比较发现,克隆获得的RGAs具有典型的NBS类抗病基因保守结构域,在与已知植物NBS类序列相似性比较中,与I2c-2基因相似性最高,为46.2%,而巴西橡胶NBS类RGAs之间氨基酸相似性为22.1%～100.0%。进一步研究发现,核苷酸非同义替换和同义替换的比率小于1,有低水平的重组,表明点突变逐步积累是导致纯化选择的主要力量。【结论】通过SA诱导作用和NBS类抗病基因结合得到的巴西橡胶NBS类RGAs具有广泛的遗传多样性,并与已知抗病基因氨基酸序列具高度相似性,这些RGAs候补序列可能与某抗病基因有密切联系。     

巴西橡胶NBS-LRR抗病基因类似物多样性分析

【目的】克隆巴西橡胶抗病基因同源序列,为巴西橡胶抗病R基因的获取奠定基础。【方法】根据已知抗病基因（Resistance gene, R gene）编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计一对简并引物 P1/P2,采集经水杨酸（SA）处理0、12、24、48 h的巴西橡胶叶片,进行cDNA同源序列克隆。【结果】序列分析结果表明,克隆获得的RGAs经系统进化分析分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR 两种类型和9个基因家族;多重比较发现,克隆获得的RGAs具有典型的NBS类抗病基因保守结构域,在与已知植物NBS类序列相似性比较中,与I2c-2基因相似性最高,为46.2%,而巴西橡胶NBS类RGAs之间氨基酸相似性为22.1%~100.0%。进一步研究发现,核苷酸非同义替换和同义替换的比率小于1,有低水平的重组,表明点突变逐步积累是导致纯化选择的主要力量。【结论】通过SA诱导作用和NBS类抗病基因结合得到的巴西橡胶NBS类RGAs具有广泛的遗传多样性,并与已知抗病基因氨基酸序列具高度相似性,这些RGAs候补序列可能与某抗病基因有密切联系。     

石栗accD因全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆石栗幼嫩叶片accD基因的全长cDNA序列,为今后利用该基因和提高油料作物种子含油量提供参考.[方法]根据已知植物麻疯树、蓖麻等accD基因的保守区域设计简并引物,以石栗幼嫩叶片为材料,利用简并PCR和RACE技术克隆accD基因的全长cDNA序列,扩增其编码序列.[结果]扩增获得的石栗accD基因全长cDNA序列长1789 bp,包含1509 bp的开放阅读框,可编码503个氨基酸,GenBank登录号为KC255250,并命名为amaccD.石栗accD基因序列经BLASTx比对后,发现其与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树氨基酸序列的同源性分别为90％、90％和89％.[结论]克隆获得的石栗accD基因全长cDNA序列与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树等具有较高同源性.     

条斑紫菜抗坏血酸过氧化酶基因的克隆及生物信息学分析

结合电子克隆及RT-PCR技术获得条斑紫菜(Porphyrayezoensis)过氧化物酶基因。该基因cDNA序列长847 bp,包含编码245个氨基酸的开放阅读框。生物信息学分析结果显示,该基因编码蛋白无信号肽序列,与高等植物拟南芥的细胞质抗坏血酸过氧化物酶蛋白序列同源性较高,在细胞质中行使功能。此外,该基因的进化历程基本符合植物从低等到高等的进化过程。     

拟南芥ATMYB2转录因子的cDNA序列分析及其细胞定位

根据GenBank中收录的拟南芥At Myb2基因(GenBank登录号:AK229140)的cDNA序列设计1对引物,对拟南芥中叶片提取的总RNA进行扩增和克隆,并将拟南芥ATMYB2蛋白氨基酸序列进行同源性比较和蛋白定位分析.结果表明:At Myb2基因cDNA全长为816 bp,编码272个氨基酸和1个终止密码子,具有2个典型的MYB类转录因子基因的DNA结合区,分别为23-70、79-118位氨基酸,属于典型的R2,R3-MYB转录因子;经过氨基酸比对发现,拟南芥ATMYB2蛋白与水稻的ATMB18蛋白同源性最高,为44.60%.对拟南芥At Myb2基因进行RT-PCR扩增,结果表明基因片段未发生任何突变;通过拟南芥ATMYB2与EGFP形成融合蛋白对AT-MYB2进行了定位,发现ATMYB2蛋白在细胞核内能够表达,符合作为转录因子的表达特征.