水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响

[目的]研究水稻白叶枯病菌fkb M基因对其运动性的影响。[方法]采用同源置换方法对水稻白叶枯病菌野生型菌株PXO99A的fkbM基因进行基因敲除,构建突变菌株ΔfkbM_(Xoo),同时构建互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)。通过运动性试验,确定fkbM基因对运动性的影响。[结果]与野生型菌株PXO99~A相比,ΔfkbM_(Xoo)突变体运动性明显减弱,而互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)能基本恢复水稻白叶枯病菌的运动性。[结论]水稻白叶枯病菌fkbM基因突变能减弱水稻白叶枯病菌的运动能力。     

水稻白叶枯病菌PXO99A无毒基因缺失突变的研究

对同源重组获得的水稻白叶枯病菌PXO99A菌株的无毒基因突变体PXO99△avr进行Southern杂交验证、突变序列分析和致病性测定.结果表明:该突变体缺失了5个无毒基因,同源重组发生在PXO99A全基因组中一个有5个无毒基因串联的位点上;与PXO99A相比,突变体在IRBB10等15个水稻品种上引致的病斑明显缩短,而在IRBB14、IRBB21和IRBB55上的病斑则变长;缺失的5个无毒基因的综合表现为毒性因子功能.推断:在缺失的基因中含有无毒基因avrXa14、avrXa21、avrxa13以及与抗病基因Xa3、Xa4、xa5、Xa10、Xa17亲和互作有关的毒性因子.     

无毒基因avrXa3介导的水稻白叶枯病菌在不同水稻品种上的致病适应性分析

水稻白叶枯病菌[Xanthomonas oryzaepv.oryzae(Ishiyama)Dye]是水稻上重要的细菌病害之一,探明无毒基因avrXa3和含不同抗病基因水稻品种间的互作对于制定有效的病害防治措施有着重要的意义。根据无毒基因avrXa3的序列,构建了水稻白叶枯PXO99A菌株缺失5个串联的无毒基因的突变体PXO99△avr。将avrXa3导入PXO99A和PXO99△avr后,得到衍生菌株PXO99A/avrXa3,PXO99△avr/avrXa3,与36个含不同抗病基因的水稻品种进行互作分析。结果显示,导入avrXa3后的菌株在不同的水稻品种上表现出明显的寄生适应性变化。进一步分析证明无毒基因avrXa3在Wase Aikoku 3、IRBB2、IRBB3、IRBB203、IRBB204、IRBB205、IRBB211、IRBB53、IR24、TN-1等11个水稻品种上病斑缩短,表现明显的无毒活性;在IRBB21、IRBB10、IRBB14、IR26、Cas209、Java14这6个品种上病斑明显变长,体现无毒基因的毒性功能。表明无毒基因avrXa3对PXO99A中其他无毒基因的表达有明显的干扰作用,单个效应分子的变化也会使细菌在不同水稻品种上的寄生适应性发生复杂的改变。     

水稻白叶枯病菌噻枯唑抗药突变体生物学性质研究

引起水稻白叶枯病的Xanthomonas oryzae在用药剂处理过的水稻上鉴别为抗噻枯唑的突变体。致病力和胞外酶活性测定结果表明，抗药性突 变体与野生敏感菌株没有明显差异，但抗药性突变体对离体稻叶的伤害作用及引起水稻体内脂质过氧化程度强于敏感菌株；胞外产物可以降低水稻白叶枯病菌对噻枯唑的敏感性，病菌产生抗药性与胞外产物关系密切；抗药突变体在无药平板上转移10代后，抗药水平明显下降，但致病力变化在不同的突变体间表现出较大差异，有的保持较强的致病力，有的则完全失去致病力。     

水稻白叶枯病菌avrBs3/PthA家族基因的随机缺失及突变体PX099△avr功能的研究

利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr.PXO99A及其突变体基因组DNA以内切酶BamH Ⅰ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱.进一步以相同探针检测PXO99A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆.众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列.经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同.因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除.将此文库克隆(p5)分别导入PXO99A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因.同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能.     

水稻白叶枯病菌avrBs3/PthA家族基因的随机缺失及突变体PXO99Δavr功能的研究

利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99~A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr。PXO99~A及其突变体基因组DNA以内切酶BamHⅠ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱。进一步以相同探针检测PXO99~A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆。众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列。经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同。因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除。将此文库克隆(p5)分别导入PXO99~A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99~A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因。同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能。     

不同遗传背景籼稻Xa23基因品系的白叶枯病抗性筛选和评价

【目的】系统比较分析含Xa23基因的籼稻品系白叶枯病抗性,为白叶枯病抗性育种及水稻白叶枯病防治等提供种子资源,同时为白叶枯病分子抗性育种提供参考。【方法】以14种遗传背景不同且含有Xa23基因的81份籼稻品系为材料,孕穗期采用剪叶接种法接种7种南方稻区白叶枯病生理小种代表菌株（FuJ、YN24、HNA1-4、GDA2、PXO86、GD1358和PXO99）,接种20 d左右当参试材料的病情趋于稳定时,量取病斑长度,鉴定参试材料的抗病性。【结果】供试材料对7株白叶枯病菌菌株的抗感分析结果显示,81份品系中有74份品系对7株白叶枯病菌菌株均为抗病,其中35份品系对所有菌株为高抗;含Xa23基因品系对7株白叶枯病菌菌株的抗性频率大小为:PXO86和YN24（100.0%）>GD1358和HNA1-4（98.8%）>PXO99（96.3%）>GDA2（95.1%）>FuJ（93.8%）;同一遗传背景品系对7株白叶枯病菌菌株病斑长度的变异系数在100.0%以上的有遗传背景为A、B、C、E、F和H类品系对菌株FuJ,遗传背景为A、B、D和E类品系对菌株GDA2,遗传背景为A类品系对菌株GD1358和HNA1-4,遗传背景为A和B类品系对菌株PXO86、PXO99,遗传背景为A、C和E类品系对菌株YN24;对14种遗传背景不同品系白叶枯病抗性的方差分析结果表明,不同来源含Xa23基因的品系与7株白叶枯病菌菌株间病斑长度均无显著差异（P>0.05）;对含Xa23基因的品系在7株白叶枯病菌菌株诱发下的菌斑长度的相关性分析结果表明,菌株GD1358、HNA1-4、PXO86和YN24与对应的其他菌株间呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）正相关。【结论】在白叶枯病抗性研究时选用菌株GD1358、HNA1-4、PXO86和YN24其中1种抗源接种试验材料,即可得到较宽抗谱的抗性材料,提高育种效率。     

67种药剂对水稻白叶枯病菌的室内毒力

本研究从各地收集了常用于防治细菌病害的67种市售杀菌剂,采用抑菌圈法测定了水稻白叶枯病菌对药剂的敏感性,以期筛选出防治白叶枯病的有效药剂。结果表明,丙硫唑、中生菌素、代森铵、松脂酸铜、甲基营养型芽孢杆菌等对白叶枯病菌的抑菌效果最好,抑菌圈直径>25.0 mm。噻唑锌、噻森铜、噻菌铜、氯溴异氰尿酸、噻霉酮等药剂在离体条件下抑菌性不佳,抑菌圈直径均<13.0 mm。     

水稻白叶枯病菌Ⅲ型效应物基因hpaF与毒力相关

【目的】稻黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)PXO99A菌株中PXO_03420基因被注释为编码具有多个LRR的Ⅲ型效应物基因hpaF,本研究旨在明确hpaF基因的功能,为完善XooⅢ型效应物的研究提供一定的理论基础.【方法】通过同源双交换构建hpaF基因的缺失突变体,并通过表型分析、致病性试验和遗传互补对该基因的功能进行研究.【结果和结论】本研究发现,hpaF基因突变后对水稻日本晴品种的致病力降低了51.81%,减弱了细菌在非寄主植物蓖麻上的过敏反应.而带有hpaF全基因片段的pLAFR3能够恢复hpaF突变体的致病表型,结果表明hpaF基因与水稻白叶枯病菌的致病性相关.     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

 用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有     

贵州水稻纹枯病菌对噻呋酰胺和己唑醇的敏感性测定

【目的】研究贵州省不同稻区水稻纹枯病菌对噻呋酰胺和己唑醇的敏感性情况,可为水稻纹枯病的科学防治和药剂的合理使用提供参考。【方法】从贵州不同水稻产区采集水稻纹枯病菌标样,对其进行分离、纯化并保存菌株,采用菌丝生长速率法测定38株水稻纹枯病菌对噻呋酰胺和己唑醇的敏感性及其交互抗性。【结果】所有供试菌株对噻呋酰胺的EC_(50)值介于(0.026 4~0.380 2)μg/m L之间,平均EC_(50)为(0.071 2±0.059 4)μg/m L;所有供试菌株对己唑醇的EC_(50)值介于(0.003 6~0.090 7)μg/m L之间,平均EC_(50)为(0.025 1±0.015 8)μg/m L。不同地区菌株对噻呋酰胺和己唑醇的敏感性不同,贵阳的菌株对噻呋酰胺的敏感性最高,铜仁地区的最低;黔南州的菌株对己唑醇的敏感性最高,黔东南州的最低。供试菌株对噻呋酰胺和己唑醇的敏感性无显著相关性。【结论】供试菌株对噻呋酰胺和己唑醇具有较高的敏感性,不同地区菌株间敏感性不同。两药剂未产生交互抗性,可以在生产上交替使用。     

水稻白叶枯病菌tatB基因的克隆及功能分析

根据水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99的tatB基因序列设计引物,采用PCR方法从PXO99中克隆了tatB基因,命名为tatBXoo。通过同源重组的方法,构建了tatBXoo的插入突变株TBM,在含有X-gluc的抗性平板上筛选,并经Southern blot杂交验证确认。表型测定结果表明:与野生型相比,tatB突变株在水稻(寄主)上的致病性减弱,但在烟草(非寄主)上仍具有引起过敏反应的能力;tatB突变导致Xoo致病相关的重要表型如胞外多糖减少,游动性及趋化性减弱。但是,tatB突变不影响Xoo在基本培养基(MMX)中正常生长、胞外纤维素酶产生和生物膜形成。     

水稻白叶枯病菌毒性表达的负调控因子PXO_02944的分子鉴定

【目的】水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo）侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用,而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白,是c-di-GMP信号蛋白家族的成员,研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO_02944的基因结构和功能。【方法】根据PXO_02944基因序列信息,以PXO99A基因组DNA为模板,设计引物扩增PXO_02944基因全长,将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析;分别扩增PXO_02944左右臂片段,将其与目的载体pK18mobsacB载体连接,得到质粒pK2944,将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接,获得重组质粒pK2944-GmR,用于构建基因突变体。将PXO_02944全长基因克隆到载体pHM1上,获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO_02944中,即获得互补菌株ΔPXO_02944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定,分析PXO_02944 基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响,并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944;生物信息学分析发现,PXO_02944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域,但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比,虽然PXO_02944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化, 但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强,T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO_02944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。     

不同水稻品种(系)对白叶枯病的抗性分析

【目的】白叶枯病是水稻上重要的细菌性病害,本文检测了不同水稻品种(系)对主要白叶枯病菌的抗性情况。【方法】选择中国流行的9个白叶枯病菌株及菲律宾的强毒性广谱致病菌株PXO99,利用剪叶法对收集的64个水稻品种(系)进行抗性分析。【结果】生理小种YN24、PXO99、YN1致病力最强,致病率分别达到了95.31%、95.31%、92.19%,致病力最弱的生理小种是YN18,致病率只有3.23%;水稻品种(系)武21621、A130、圣稻740对10个生理小种都表现抗病,C418、K18对10个生理小种都表现感病,其它品种(系)对10个生理小种抗性表现不一。同时,PCR分析表明对10个菌株表现抗病的水稻品种圣稻740可能含有新的抗病基因,是一个潜在的抗病资源。【结论】这些研究结果对指导水稻白叶枯病抗性育种工作具有参考价值。     

高温胁迫诱导水稻白叶枯病菌在病叶中进入存活但不可培养状态的研究

[目的]探究水稻白叶枯病菌是否存在存活但不可培养状态（viable but non-culturable, VBNC）,将有助于更好地了解水稻白叶枯病的病害循环，为有效防治水稻白叶枯病提供理论基础。[方法]对分离采集自田间、保存在室温和4℃下1～4年的水稻白叶枯病叶，采用划线稀释分离法进行病原菌的平板分离，探索不同温度处理下病叶中白叶枯病菌的可培养情况。将带利福平抗性的白叶枯病菌PXO99^A菌株剪叶接种感病水稻品种‘深两优871’,病叶剪成小段分别置于4、28和37℃下保存，每隔30 d取病叶小段，通过平板分离进行病原菌含量的测定。利用染色全细胞染料Microlight^TM Green JJ98 and JJ99以及染死细胞染料碘化丙啶（PI）对喷菌液中细胞的存活程度进行测定。[结果]采集自田间、保存在室温和4℃下的病叶都有明显的喷菌现象；只有从4℃保存（甚至保存4年）的样品上可以分离到病原菌，而保存在室温的样品上都不能分离到白叶枯病菌。从人工接种的保存在3个温度下的病叶上分离的病原菌，随着保存时间的增加，可培养的PXO99^A     

福建省稻瘟病菌对4种杀菌剂的敏感性分析

【目的】明确福建省水稻稻瘟病菌对吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵的敏感性,为稻瘟病菌的抗药性监测及防治提供依据。【方法】以从福建将乐、沙县、宁化、建阳、南靖、上杭6个地区采集分离的116株稻瘟病菌为试验材料,采用菌丝生长速率法测定吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵对供试菌株的有效抑制中浓度(EC₅₀),分析供试菌株对吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵的敏感性及其相关性,建立供试菌株对4种杀菌剂的敏感性频率分布图,确定其敏感基线。【结果】吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵对供试稻瘟病菌菌株的EC₅₀分别为0.001 2～0.012 8,0.209 8～0.632 3,0.196 8～2.273 0和0.217 6～0.616 1 μg/mL,EC₅₀平均值分别为0.004 7,0.361 9,0.812 4和0.427 9 μg/mL,表明福建省稻瘟病菌对吡唑醚菌酯最敏感,其次为戊唑醇、多菌灵和丙环唑。不同地区稻瘟病菌菌株对同一种杀菌剂的敏感性存在差异,同一地区稻瘟病菌菌株对同一种杀菌剂的敏感性也存在差异;敏感性频率分布的正态性检验结果显示,福建省稻瘟病菌对吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵的敏感性频率分布均为连续性单峰曲线,且未出现敏感性下降的亚群体,因此,可分别将吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑和多菌灵对供试菌株的EC₅₀平均值（0.004 7,0.361 9,0.812 4和0.427 9 μg/mL）作为其敏感基线,用于田间菌株的抗药性监测。供试稻瘟病菌对吡唑醚菌酯的敏感性与戊唑醇、丙环唑、多菌灵的敏感性之间无显著相关性。【结论】4种杀菌剂对福建稻瘟病菌的敏感性依次为吡唑醚菌酯＞戊唑醇＞多菌灵＞丙环唑;吡唑醚菌酯可作为防治稻瘟病的主要杀菌剂,并与戊唑醇、多菌灵和丙环唑轮换或混合使用,避免或延缓稻瘟病菌对其产生抗药性。     

2020—2021年江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗药性监测

前期研究发现江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂存在抗药性风险,为进一步明确江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂的抗药性发展规律,指导全省三唑类杀菌剂的科学使用,利用菌丝生长速率法,测定了2020年江苏省6个地区和2021年江苏省7个地区共计219个稻曲病菌单孢菌株对三唑类杀菌剂的敏感性,并通过测定抗性菌株的生长速率和对水稻的致病力对其适合度进行了分析。结果表明,2020年采集的84株稻曲病菌对丙环唑均敏感;2021年,在靖江市监测到1株抗药性菌株,该市抗性频率为6.7%,全省抗性频率为0.7%;抗性水平2.2倍。进一步对筛选到的稻曲病菌抗药性菌株适合分析发现,抗药性菌株生长和致病力与敏感菌株相比均无显著差异,表明在三唑类杀菌剂的田间选择压下,抗药性可能会进一步发展。本研究明确了江苏省稻曲病菌对三唑类杀菌剂存在低抗药性风险,目前在做好抗药性监测的前提下,三唑类杀菌剂可继续作为江苏省防治稻曲病的主要药剂。     

水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因的敲除

wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzicola，Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）合成基因，avrXa3是水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo）的一个无毒基因。利用pBCSK（-）和pKNG101两个质粒的复制起点不被水稻黄单胞菌识别的特点，把wxocA、wxoeD、wxocE和wzt的中心区域克隆在pBCSK（-）上，获得突变转化单元pBCSK：：ΔwxocA、pBCSK：：hwxocD、pBCSK：：AwxocE和pBCSK：：Δwzt。把wxocB和avrXa3基因的旁侧序列和一个氯霉素抗性基因cm构建在pKNG101上，获得突变转化单元pKNG101：：ΔwxocB和pKNG101：：Δavr。以电转化方式把这些LPS合成基因突变转化单元DNA转入Xooc菌株RS105，把无毒基因突变转化单元转入Xoo菌株PXO99，通过同源重组分别获得了RS105中5个如相应基因突变体MwxocA、MwxocB、MwxocD、MwxocE、Mwzt和一个无毒基因的突变体PX099Δavr。SDS-PAGE分析发现，lps突变体的O抗原或核心寡糖的合成被破坏。致病性分析结果显示，基因wxocB、woxocE和wzt与致病性有关，前两基因的突变导致细菌完全失去毒性，而后一基因的突变导致细菌部分丧失毒性。与PX099相比无毒基因突变体PX099Δavr改变了原有的毒性表型，在IRBB50（Xa4／xa5）和Asominori（Xa17）上由较感转变为较抗表型。因此，本试验证明，以pBCSK（-）和pKNG101为载体敲除水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因是可行的。     

广西水稻白叶枯病菌致病型的初步鉴定

【目的】明确广西水稻白叶枯病菌致病型的分布和分化,为生产上该病害的综合防控提供理论依据。【方法】采用水稻白叶枯病菌中国鉴别寄主（金刚30、特特普、南粳15、爪哇14、IR26）对2013年从广西南宁、东兴、防城港、钦州、岑溪等地水稻病区分离得到的29株水稻白叶枯病菌进行致病型初步鉴定,同时采用部分近等基因系对5株南宁分离菌株致病性进行进一步分析。【结果】29株菌株在5个鉴别寄主上均出现感病反应,均为SSSSS模式,为强致病菌;5株南宁分离菌株能使目前抗谱最广的水稻材料CBB23感病。【结论】广西水稻白叶枯病菌致病力出现极大分化,需加强对该病害的防控及水稻抗病材料的筛选利用工作。