薄壳山核桃疮痂病菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

疮痂病是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害,带菌植物材料是传播疮痂病的重要来源。准确、灵敏、快速的检测方法可为该病害流行规律调查和防控提供有力的依据。本文通过比较薄壳山核桃疮痂病菌Venturia effusa及其近似种之间的ITS序列差异,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法。特异性检测结果表明,该方法可以检测不同地区的薄壳山核桃疮痂病菌菌株,而对其近似种以及薄壳山核桃上的其他真菌均没有信号。本研究建立的检测方法对薄壳山核桃疮痂病菌DNA的最低检测限可达0.5 pg/μL。该方法用于田间样品检测时,检测时间仅需1 h,远快于常规的分离培养法。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法为薄壳山核桃疮痂病菌的快速检测和监测提供了有力工具。     

EAsdiA基因的克隆和作为新靶标对梨火疫病菌的检测

基因sdiA属于与群体效应相关的LuxR家族,目前已证实存在于Escherichia coli和Salmonella typhimurium基因组中。本研究从梨火疫病菌(Erwinia amylovora)中克隆到了一个sdiA的同源基因,命名为EAsdiA(GenBank登录号:AY864839),该基因与E.coli和S.typhimurium的sdiA基因在氨基酸水平上分别有45.42%和43.33%的同源性,与其它细菌的luxR同源基因的同源性更低。根据梨火疫病菌EAsdiA和其它病原细菌的luxR基因的序列比对设计了1对特异引物F-EAluxR和R-EAluxR,能够特异地检测梨火疫病菌,检测灵敏度为10个菌体,在含有梨组织浸出液中可检测到102个菌体。本研究首次从梨火疫病菌中克隆sdiA基因并作为新靶标应用于该病菌分子检测。     

棉花黄萎病菌毒素结合位点初探

以纯化的棉花黄萎病菌毒素(PLPC)免疫新西兰白兔制备了PLPC特异性抗血清。将PLPC(15μg·ml 1)用不同浓度的抗体(1～20μg·ml 1IgG)吸附后处理泗棉3号的切根苗,毒素所引起的症状都有不同程度的减轻。表明所制备的抗体在与毒素发生特异性免疫学反应的同时,可部分封闭毒素分子上与毒素受体结合的位点。利用竞争ELISA测定了泗棉3号幼苗子叶的质膜制剂与PLPC的结合活性。结果表明,质膜制剂与毒素结合后能部分阻断毒素与其抗体的免疫学反应,即质膜制剂中含有毒素的结合位点。分别用胰蛋白酶和煮沸处理质膜制剂后,质膜制剂对毒素与其抗体的反应的抑制作用消失,初步表明质膜制剂中与毒素结合的是蛋白质。     

“农药残留免疫检测技术研究及检测试剂盒研制”获得重大进展

由南京农业大学主持、中国家科院等单位参加的“十五”863课题“农药残留免疫检测技术研究及检测试剂盒研制”经过课题组二年多的协作攻关，基本完成了课题前三年的研究任务。     

拮抗细菌菌株Bacillus spp.间的相互作用及其对水稻纹枯病的抑制

测定了6个Bacillus spp.和1个Pseudomonas sp.P-13(G-对照菌株)在PPM培养基上的相互作用。在总共42个组合中，有27个组合是可亲和性的。在以B5423为单剂之一的5个组合中，亲和性的组合有4个。在温室条件下通过分批播种，在水稻分蘖盛期喷以B5423-R(B5423的标记菌株，是利福平抗性的突变体)为单剂之一的4个亲和性组合的菌悬浮液，以检测该组合中B5423-R在水稻茎基部的种群数量。结果发现，与单剂B5423-R相比，在应用1～7天内，组合B5423-R B45中，B5423-R的群体数量显著性降低；组合B5423-R B95、B5423-R B77中，B5423-R的群体数量与单剂无显著差异；组合B5423-R B4313中，B5423-R的群体数量在应用1～4天内与单剂无显著性差异，但在应用第7天显著地高于单剂。离体叶片纹枯病痛斑面积的抑制试验表明，与各自的单剂相比，组合B95 B5423及B95 Er77显著地抑制了纹枯病病斑面积；而组合B45 B80、B45 B5423和B45 B95纹枯病病斑面积显著地高于各自的单剂；其余10个组合与各自的单剂无显著差异。     

利用PCR和间接免疫荧光染色技术检测风信子黄腐病菌

根据风信子黄腐病菌(Xanthomonas hyacinthi,XHA)的fimA基因,合成了1对特异性引物JAAN/JARA ,目的片段为226 bp,用来检测样本中有无目标细菌.用XHA全菌体免疫家兔,获得抗血清,建立了检测风信子黄腐病菌的间接免疫荧光染色检测技术.用上述两种方法对风信子黄腐病菌和人工接种发病样品进行检测.结果表明,这两种方法可以准确、灵敏地检测风信子黄腐病菌及带菌样品,方法简单、快速、实用,可以在口岸检疫中推广使用,以减少风信子黄腐病菌进入中国的风险.     

梨火疫病菌在中国的潜在分布及入侵风险分析

 【目的】细菌性梨火疫病最早发生在北美洲，随着水果贸易等人为因素向世界其它地区传播。对当地的生物多样性和经济带来了极其严重的威胁，亟需对其在中国的适生区进行预测。【方法】苹果开花期的温度和降水量是影响梨火疫病菌适生分布的关键气候因子，本研究根据这一生物学特性及生态环境因子，应用地理信息系统分析得出了梨火疫病在中国两个苹果优势产区的潜在定殖区域。【结果】用该方法对梨火疫病在欧洲的发生情况的预测结果与其历史分布记录相符，使用相同的空间建模方法对梨火疫病在渤海湾和黄土高原两个苹果优势栽培产区的潜在定殖区域进行风险评估，结果表明这两大苹果产区中优先扶持的县大多处于梨火疫病发生的高风险范围。【结论】梨火疫病在中国的大部分地区适生，在有适宜寄主分布的地区，就可能严重发生。     

西瓜噬酸菌pilN基因功能分析

为了分析菌毛组装蛋白家族基因对瓜类细菌性果斑病菌致病性的影响,以xjl12菌株为背景构建转座子(Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选致病性相关突变体,通过两亲交配获得突变株,并对所得的突变体、野生型及互补等多个菌株进行致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,用反转录PCR(qRT-PCR)方法验证xjl12和突变体中hrpG、hrcV、celA表达量的差异。结果表明:突变体文库中筛选得到1株致病力明显下降的突变体Δxj-7,经亚克隆鉴定为pilN基因,其功能主要与菌毛(pili)生物合成相关。两亲交配后所得突变菌株ΔpilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明菌毛生物合成相关基因pilN对致病性有重要的调控作用。     

pyrG基因对西瓜噬酸菌致病性和组氨酸利用的影响

为研究pyr G基因与西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)致病相关性,利用同源重组的方法构建pyr G基因突变体(Δpyr G),对pyr G基因的功能进行分析。结果显示,pyr G基因影响病原菌的致病性、游动性、生物膜形成和定殖能力以及激发烟草过敏反应能力;pyr G基因影响his D基因的表达;此外,pyr G基因突变影响西瓜噬酸菌对组氨酸的利用。     

瓜类细菌性果斑病菌过敏性反应和致病性(hrp)基因簇部分基因的克隆及功能分析

过敏性反应和致病性(hrp)基因存在于革兰氏阴性植物病原细菌中,决定病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应(hypersensitive response,HR)。本研究从果斑菌(Acidovorax avenaesub sp.citrulli)的hrp基因簇中克隆了hpaA、hrcT、hrcC和hrpG基因,通过同源重组的方法,分别构建了其突变体。电镜观察发现,hpaA和hrpG基因突变体的鞭毛缺失且细胞形态发生显著变化,而hrcT和hrcC基因突变体的鞭毛和细胞形态未发生明显变化。在烟草(Nicotiana tabacam)和哈密瓜(Hami cantaloupe)叶片上的测定结果显示,hpaA、hrcT和hrcC的突变体均失去在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜叶片上的致病性;hrpG在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜上的致病性则显著减弱;进一步的生长曲线测定结果表明,hpaA、hrcT、hrcC和hrpG的突变体的定殖能力均显著下降。相应地,功能互补后突变体基本恢复至野生表型。证明瓜类细菌性果斑病菌hrp基因作为Ⅲ型分泌系统关键组份影响病原细菌对寄主植物的致病性和对非寄主及抗病植物的过敏性...