辽宁省新城疫病毒F基因和HN基因的分子特征与致病性

采用RT-PCR对新城疫病毒辽宁分离株的F基因和HN基因进行扩增并测序,初步研究其分子特性分析和致病性。结果表明,分离株CY1株、DD2株、YK1株和TL4株的致死鸡胚平均时间(MDT)分别为50.6 h、76.3 h、62.9 h和81.3 h,CY1株具有强毒特征。F基因分型显示,CY1株属于Ⅶ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒氨基酸基序特征,与流行株js02株的亲缘关系非常近,与疫苗株LaSota、Queensland V4亲缘关系均较远。DD2株、YK1株和TL4株均属于基因Ⅱ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112GRQGRL117,符合NDV非强毒氨基酸基序特征,与LaSota株亲缘关系最近。本研究将为本省新城疫防制对策的制定提供参考。     

新城疫病毒云南分离株F基因变异特性分析

采用RT-PCR技术对云南2007年-2009年采集的948份喉气管拭子或组织样品中新城疫病毒F基因进行检测,获得阳性样品65份,选择30份代表性阳性样品采用特异性引物经RT-PCR扩增F基因,纯化后克隆至pMD18-T载体,并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,新城疫病毒云南分离株F基因核苷酸与疫苗LaSota株之间的同源性为70.5%～99.8%,与F48E9株之间的同源性为70.7%～90.8%。系统发育分析表明,30株病毒中21株属于基因型Ⅶ,裂解位点氨基酸为R-R-Q-K-R-F,与传统认为强毒裂解位点氨基酸序列相同;7株属于基因型Ⅱ,5株裂解位点氨基酸为G-R-Q-G-R-L,属于弱毒株裂解位点氨基酸排列特征,2株裂解位点氨基酸为R-R-Q-K-R-F属于强毒裂解位点氨基酸序列;2株病毒与9个基因型的同源性差异较远。     

免疫鸡群新城疫病毒的分离与分子鉴定

从免疫鸡群中分离到9株新城疫病毒（NDV），其中5株为强毒株，4株为中强毒株。用RT—PCR扩增F基因cDNA片段，并将其分别克隆到pGEM—Teasy载体中。序列分析结果表明，上述分离株F基因长度为1662bp，编码553个氨基酸，其F蛋白的氨基酸序列同源性为96．0％～99．8％；但与常见疫苗株的氨基酸同源性仅为87.6％～92.2％，F蛋白裂解位点序列为^112R-R-Q／R—K—R—FI—G^119,均属于基因Ⅶ型NDV。     

从种蛋中分离的新城疫病毒抗原性及其F和HN基因的分析

对3株首次从种蛋中分离到的NDV进行交叉HI试验表明,这3株分离毒的交叉HI同源性为98.1%～100%。对这3株病毒及另1株从输卵管分离到的NDV的F与HN完整基因进行扩增并克隆测序,序列结果登陆GenBank(FJ011441～FJ011448)。氨基酸同源性分析表明:这4个毒株的F与HN基因同源性分别为99.5%～99.8%和99.6%～100%,远高于其与Lasota、F48E8株以及目前国内流行的其他基因Ⅶ型毒株的同源性。分离株F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特征,根据绘制的遗传进化树分析,属于基因Ⅶ型。研究结果显示这4个不同来源毒株其2个基因的同步高度同源性可能与它们均是与生殖道感染有关。     

鸡新城疫病毒新疆分离株F基因遗传进化分析

对2株分离自新疆乌鲁木齐市的鸡源新城疫病毒F基因进行了扩增、序列测定和分析.结果显示,该2株新城疫病毒F基因核苷酸序列长度分别为1586 bp和1654 bp,分别编码520和545个氨基酸；氨基酸裂解位点的序列均为112R-R-Q-K-R-F117,具备了基因Ⅶ型强毒株的特征；同源性分析表明,该2株新城疫病毒分离株与...     

几株野生鸟类来源的Ⅰ型禽副粘病毒分子生物学特征的研究

参考GenBank中Ⅰ型禽副粘病毒（Avian paramyxovirus,APMV-1）序列,在F基因的3’端相对保守区设计1对引物,利用RT-PCR方法对华南农业大学兽医学院禽病学教研室近两年来从广州和深圳两个地区分离的4种动物来源共10株Ⅰ型禽副粘病毒毒株的F基因进行扩增,其扩增长度约为450bp。测序结果表明：广州株与NDV的基因Ⅵ型有高度的同源性,1个深圳株与Ⅶ型有较高的同源性,其氨基酸序列均符合F蛋白裂解位点区（112-117）强毒株的氨基酸序列特征;其他4个深圳株均与基因Ⅰ型有很高的同源性,其氨基酸序列均符合F蛋白裂解位点区（112-117）弱毒株的氨基酸序列特征。     

广东地区8株鹅源基因Ⅻ型新城疫病毒F蛋白基因遗传进化分析

为了解当前广东地区鹅群新城疫病毒(NDV)遗传进化情况,本研究从广东养殖病死鹅组织样品中分离鉴定获得8株NDV,对分离株的F蛋白基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。8株分离病毒之间F蛋白基因同源性较高,为96.3%-99.9%,但与当前国内NDV优势流行株及疫苗株同源性均较低。遗传进化分析结果显示所有新分离株均属于Ⅻ型NDVⅫb亚型分支,而当前国内NDV的优势流行株及常用疫苗株均属于Ⅶd亚型分支。氨基酸序列分析结果显示,本研究分离株F蛋白裂解位点氨基酸序列均为~(112)K/RRQKR/F~(117),符合强毒株分子特征;与基因Ⅶ型代表株NDV/ZJ1相比,新分离株F蛋白B细胞中和抗原表位均出现D~(170)N变异;而与2010年～2011年报道的广东Ⅻb亚型分离株相比,新分离株F蛋白疏水区、七肽重复序列等区域均出现氨基酸的变异。综上所述,本研究分离鉴定的8株鹅源NDV的F基因均属于Ⅻb亚型,与Ⅶd亚型流行株及常用疫苗株F基因同源性较低,且其多个氨基酸关键位点存在变异。本研究在国内首次从病死鹅体内分离到基因Ⅻ型NDV,为进一步了解基因Ⅻ型NDV在广东地区水禽中的流行、病原进化以及疫苗株更新提供参考。     

新城疫病毒贵州分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒（NDV）F基因序列设计了一对引物,用RT-PCR方法扩增了8个NDV贵州分离株的F基因片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1662bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.0%～99.7%和87.5%～99.3%,但与LaSota、B1及F48E9等常见毒株的氨基酸同源性为87.2%～97.7%。F蛋白裂解位点的氨基酸序列分别为112R-R-Q-R/K-R-F^117（其中P1、H2、N98、DQ、FW、BY、GZ7株为强毒）和112G-R-Q-G-R-L^117（TN1株为弱毒）。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树,结果表明,4个分离株（P1、H2、、N98、DQ）为基因Ⅶ型,2株（GZ、TN）为基因Ⅱ型,2株（FW、BY）为基因Ⅸ型。     

4株新出现的Ⅰ类新城疫病毒F基因的变异分析

为了分析我国新出现的Ⅰ类新城疫病毒的分布和分子特性,对2016年分离到的4株Ⅰ类新城疫病毒进行F基因序列分析和遗传进化分析。结果显示:4株Ⅰ类新城疫病毒F基因编码长度均为1 662nt,共编码553个氨基酸,分离株之间氨基酸相似性为97.9%~100%。4株分离株F蛋白裂解位点的氨基酸组成均为112 ERQERL117,符合新城疫病毒弱毒株的分子特征。F基因高变区(47—420nt)遗传进化分析结果显示这4株病毒为国内新出现的基因型,利用F基因编码区全长序列构建系统进化树显示4株病毒属于基因1c亚型,与北美分离株高度同源,而与国内基因1c亚型分离株(Duck/Guangxi/1261/2015)相似性仅为95.5%~97%。监测数据表明这种新出现的Ⅰ类新城疫病毒具有在国内进一步流行和扩散的风险。     

3株新城疫病毒广西分离株F基因和HN基因序列分析

根据已发表的新城疫病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的2对引物,利用RT-PCR扩增了3个广西分离株的F基因和HN基因片段,并将其分别克隆到pMDl8-T载体中。结果表明:上述分离株F基因序列全长为1 662bp,编码553个氨基酸;HN基因序列全长为1 716bp或1 734bp,编码571或577个氨基酸。与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.8%~99.9%之间,氨基酸序列的同源性在88.4%~99.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在80.9%~98.8%之间,氨基酸序列的同源性在86.9%~98.6%之间。系统进化树分析表明,GX21株NDV为基因Ⅰ型,GX215株NDV为基因Ⅱ型,GX117株NDV为基因Ⅶ型。     

两株新城疫病毒山东分离株的克隆及遗传变异分析

本试验根据已发表的新城疫病毒（NDV）的F基因序列设计特异性引物，对山东地区两株NDV流行株的F基因进行了克隆与序列分析，分别扩增到了A株和B株F蛋白编码区全基因，ORF全长均为1662bp。应用分子生物学软件对A株和B株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了分析。两毒株核苷酸序列同源率为87％，都编码553个氨基酸，氨基酸同源率为91％。与部分已发表的毒株相比：A株与－株同源率最高，为98％，B株与JS鹅株同源率最高，为98％。分离株都具有3个强疏水区。A株、B株裂解区氨基酸序列符合强毒株特点，二者均为强毒株。从基因分型情况看，A株属于基因Ⅸ，B株属于基因Ⅶ。A株与F48E9株遗传距离最近，B株与JS鹅株遗传距离最近。     

1株广东鸡源新城疫病毒的分离鉴定和毒力基因分析

从广东粤东地区某商品蛋鸡场的发病鸡群中分离到1株病毒（YS株）,经血凝和血凝抑制试验确定为新城疫病毒（NDV）.对该分离株的F蛋白氨基酸序列的分析结果表明,其F0裂解位点的氨基酸序列为1nR-R-Q-K-R-F117,且含有101K和121V,符合典型NDV强毒株的分子特点.遗传分析结果显示分离株属于基因Ⅶd亚型.F和HN基因的氨基酸相似性分析表明,分离株与基因Ⅶ型NDV Chicken/China/Shandong/02/2010株的相似性最高,均达到99％,而与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和La Sota的相似性则较低,分别在86.8％～ 90.4％和87.2％～88.3％之间,说明分离株与经典的NDV毒株存在一定的差异.     

2021—2022年我国8株鸽新城疫病毒基因组特征

为了解我国最新流行的鸽新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）分子生物学特征,对2021—2022年国家新城疫参考实验室从不同地区鸽群中分离到的8株NDV代表株进行了全基因组测序和生物信息学分析。结果显示：8株鸽NDV基因组长度均为15 192 nt,基因排列方式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,其F蛋白裂解位点氨基酸序列均为112RRQKR/F117,呈典型的NDV强毒分子特征;相较于参考序列,代表毒株F蛋白七肽重复区域、融合肽和跨膜区域,以及HN蛋白中和抗原表位、跨膜区域等功能区域均有多处氨基酸变异;代表毒株全基因组核苷酸同源性为91.9%～99.0%,均属于Class Ⅱ基因Ⅵ型病毒,但可分为2个小分支,其中4株属于基因Ⅵ.2.1.1.2.2亚型,另4株属于基因Ⅵ.2.1.1.2.1亚型。结果表明,我国近期流行的鸽NDV具有遗传多样性特征。本研究进一步掌握了我国鸽NDV的遗传进化特点,丰富了鸽新城疫的流行病学信息,为该病的科学防控提供了参考。     

10株新城疫病毒分离F基因的克隆及遗传变异分析

对10株具有一定代表性的NDV分离株的F基因进行RT-PCR扩增和序列测定,核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较结果表明:F基因核苷酸序列的同源性为93.6%,推导氨基酸序列同源性为95.39%;根据F基因裂解位点的氨基酸序列推测,其中2株属于弱毒株,8株属于强毒株,该结果与致病性试验测定的结果完全相符;不同年代、不同宿主分离株的F基因序列一致,高度保守.通过BLAST SEARCH比较,8株强毒株与广东鹅分离株GDGO(Y97)高度同源,处于进化树的同一分支.2株弱毒分离株与La Sota疫苗株仅有1～4个氨基酸改变,推测可能是免疫或散播La Sota疫苗株.抗原性指数分析表明HI分离株有三处明显变异,抗原位点推测分析表明H分离株比F48株和La Sota多出6个抗原位点,而Liu株抗原位点在446位后缺失.     

鸭新城疫病毒分离株抗原表位和遗传演化分析

从规模化养殖场鸭群气管和泄殖腔试子分离到新城疫病毒(NDV)27株,用2株针对NDV HN单抗进行抗原表位分析,并选择4个分离株进行F基因高变区(374bp)和HN基因全长序列分析。抗原表位分析结果显示,27个鸭分离株均能与其中一株单抗C3-B7反应,而与另外一株单抗1E5反应为阴性。F基因(374bp)序列分析结果显示,4个鸭分离株均属于NDV ClassⅠ分支,分离株之间核苷酸同源性为99.2%～100%;分离株与NDV ClassⅡ毒株遗传距离为0.9%～9.9%,与NDV ClassⅠ毒株遗传距离为38.5%～41.7%。根据核苷酸序列推导的氨基酸序列表明,4个鸭NDV分离株F蛋白裂解位点氨基酸模式为:112-EROERL-117。HN基因序列分析结果显示,4个鸭NDV分离株HN基因全长1851bp,编码585个氨基酸;同源性比较发现4个鸭NDV分离株之间核苷酸同源性为99.7%～99.8%,与NDV ClassⅡ毒株核苷酸同源性为68.4%～70.5%,与NDV ClassⅠ毒株核苷酸同源性为95.8%～98.0%。本研究结果显示,鸭分离毒均属于NDV ClassⅠ弱毒,在抗原表位和基因序列上与广泛应用的NDV弱毒疫苗株(LaSota)不同,这些毒株的来源有待进一步深入研究。     

1株鸭源Ⅰ类新城疫病毒分离株F和HN基因的分子特性分析

采用RT-PCR技术对Ⅰ类新城疫病毒(NDV)09-014分离株完整的融合蛋白(F)基因和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因进行了扩增和遗传进化分析。F基因的序列测定结果表明:该分离株F基因全长为1 792 bp,可编码553个氨基酸,裂解位点的氨基酸组成为112E-R-Q-E-R-L117,具有典型的新城疫弱毒株特征。同源性分析表明本分离株的F基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性为93%～95.2%,而与Ⅱ类新城疫病毒代表毒株的同源性较低,介于70.6%～72.4%。HN基因的序列测定结果表明:HN基因全长2 001 bp,可编码616个氨基酸,同源性分析表明本分离株的HN基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性在92.7%～94.7%之间,而与Ⅱ类新城疫病毒同源性较低,为70.7%～71.5%。根据完整的F基因和HN基因构建的遗传进化树均表明:本分离株在分类地位上属于Ⅰ类新城疫病毒基因3型,因此Ⅰ类新城疫病毒的F基因和HN基因具有相似的进化速率。     

4株NDV分离株F基因的克隆与序列分析

对4 株具有一定代表性的NDV(新城疫病毒)分离株的F基因进行RT PCR(反转录聚合酶链反应)扩增和序列分析,根据基因裂解位点的氨基酸序列推测,其中1 株属于弱毒株,3 株属于强毒株;核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较结果表明,3株强毒株与Clone30 基因核苷酸序列的同源性在83.6%~84.0%之间,与F48 E9典型NDV强毒株同源性在86.5.6%~88.3%之间,推导的氨基酸序列同源性与Clone 30 株在85.9%~87.0%之间,与F48E9典型NDV强毒株在89.1%~91.3%之间;利用MegAlign软件绘制了NDV 的系统发育进化树,结果表明, 3株分离强毒株为Ⅶ基因型,弱毒株为基因Ⅱ型。     

鸡副黏病毒YM毒株F基因的克隆及遗传进化关系研究

近年来,我国相继有新城疫强毒株出现的报道,为分析这些强毒株与疫苗株之间的遗传进化关系,研究新城疫的流行病学特点,文章以华中农业大学病毒室分离的YM毒株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增F基因的cD-NA,将其连接入pMD18-T载体,经筛选证明已获得鸡副黏病毒YM毒株F基因的阳性克隆子。核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,YM毒株属于NDV基因Ⅶ型强毒株;F蛋白氨基酸序列与中国标准强毒株F48E9 F蛋白氨基酸序列同源性为86％,与弱毒疫苗Lasota／46株氨基酸序列同源性仅为83％,证明为变异株,且其重要的抗原位点343位氨基酸由Leu→Pro,免疫原性发生了较大变化。从基因进化树也可见,其与中国标准强毒株F48E9,弱毒疫苗Lasota／46株的进化关系较远,这从分子角度解释了为什么高免的鸡仍然暴发新城疫。     

云南2株基因Ⅱ型新城疫病毒F基因变异特性分析

对云南省2个发病鸡场的组织病料进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测,证明分离毒株为新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）。采用特异性引物经RT-PCR扩增F基因,纯化后克隆至pMD18-T载体,并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,分离获得的云南省2株 NDV毒株F基因核苷酸与La Sota株的核苷酸同源性为99.4%～99.6%,与国内外分离的流行毒株SP13和NDV027344核苷酸同源性均为99.7%～99.8%,与F48E9株的核苷酸同源性为89.0%～89.1%;F蛋白氨基酸与La Sota株的氨基酸同源性为99.3%～99.5%,与流行毒株SP13和NDV027344的氨基酸同源性均为99.5%～99.6%,与F48E9株的氨基酸同源性为91.8%～92.0%。系统发育分析结果表明,2株病毒均属于基因Ⅱ型,裂解位点氨基酸为G-R-Q-G-R-L,属于弱毒株裂解位点氨基酸排列特征。     

秦岭北麓关中地区野鸟源基因Ⅸ型新城疫病毒病原学监测及分离株毒力测定

为评价秦岭北麓关中地区野鸟源基因Ⅸ型斯城疫病毒(NDV)流行及毒力情况,对374份源于该区域健康野鸟的咽喉、泄殖腔拭子进行病毒分离与鉴定,并对NDV分离株进行生物学特征和遗传进化分析.结果共分离到5株野鸟源NDV(包括2株候鸟源),其致病指数MDT、ICPI、IVPI差异较大,分别为37.2～64.8 h,0.425～1.638,2.04～2.76.F基因(535 bp)推导氨基酸序列和同源性分析显示,5株NDV分离毒均具有强毒的融合(F)蛋白裂解位点112R-R-Q-R-R-F117,5株分离毒间同源性高达99.8％～100.0％.F基因高变区(42～420 nt,374 bp)分析显示5株分离毒均属于我国特有的基因Ⅸ型NDV,与我国早期的基因Ⅸ型NDV流行株F48E9亲缘关系很近(核苷酸同源性为99.4％～99.6％),而与La Sota和V4等传统疫苗株及目前家禽中流行基因Ⅶ型NDV毒株亲缘关系较远.本研究表明,健康野鸟为基因ⅨNDV的携带者,尽管首次获得的5株野鸟源基因Ⅸ型NDV毒株生物学特征差异较大,但均具有强毒的分子生物学特征及致病性,提示对周边环境和家禽养殖业存在潜在威胁.