α-银环蛇毒素单克隆抗体的研究进展

作者介绍了α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin,α-BGT）的特性、免疫原性、蛇毒抗血清作用及整体概况，并重点叙述了α-BGT单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)与抗血清相比的独特优势、α-BGT McAb的制备方法及α BGT McAb在医学、分子生物学和毒素检测上的应用现状及展望。提示制备α-BGT McAb及开发检测α-BGT试剂盒有较大的经济价值。     

相思子毒素-a单克隆抗体的制备与鉴定

用含1%甲醛的磷酸盐缓冲液对相思子毒素-a(abrin-a)减毒处理制备类毒素,以类毒素为免疫抗原分4次免疫3只BALB/c小鼠。采用聚乙二醇(PEG)法,取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选分泌抗abrin-a的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株。将阳性细胞株接种BALB/c小鼠制备McAb腹水,根据亚类鉴定结果,分别采用蛋白A或蛋白G亲和层析柱纯化腹水,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测McAb特异性,Western-blot法分析McAb抗原识别位点。结果获得1G5、3C2和4G1共3株McAb杂交瘤细胞株,均为抗abrin-a的特异性McAb,与相思子凝集素、蓖麻毒素(ricin)和蓖麻凝集素均无交叉反应,其中4G1为特异性结合abrin-a A链的McAb,1G5和3C2两株为特异性结合abrin-a B链的McAb;制备的McAb可用于abrin-a含量的检测。     

应用单克隆抗体技术分析鼻疽菌与类鼻疽菌表面抗原的初步研究

应用7个抗鼻疽菌的单克隆抗体(McAb)对17株鼻疽菌与29株类鼻疽菌的表面抗原作了初步分析。结果:(1) 鼻疽菌表面抗原的表达比较急定,大多数菌株趋于一种类型;(2)类鼻疽菌的表达变异性较大,用McAb 2A_5和1A_3可将其分成三个群,用McAb 1A_(10)和4D_4又能将其中的一群和二群再各分成二个亚群(1a、1b和2a、2b),(3)只有1a亚群与鼻疽菌表面抗原的表达类型交叉(占13.85％),因而使类鼻疽菌与鼻疽菌的鉴别率可达到86.15％。     

单克隆抗体与寄生虫疫苗

单克隆抗体(McAb)具有众多优点使之用于动物寄生虫病的免疫学诊断、免疫治疗及其疫苗的研制。首先,用McAb筛选某种动物寄生虫的抗原,再以McAb和这种特异性抗原建立直接(检测寄生虫抗原)和间接(检测抗寄生虫抗体)的免疫学诊断方法。其次,McAb作为免疫保护的试剂。McAb所以在一定程度上预防寄生虫的感染与再感染。     

抗伊氏锥虫表膜单克隆抗体的研究Ⅰ.杂交瘤细胞株的建立与鉴定

利用淋巴细胞杂交瘤技术,建立了3株抗伊氏锥虫表膜抗原的McAb杂交癌细胞株1C_2、2A_3、5B_7,对其鉴定的结果;①杂交瘤细胞所诱生的腹水效价,1C_2为2×10~(-4)、2A_3 4×10~(-4)、5B_7 64×10~(-4);培养上清效价,1C_2为1/512、2A_3 1/512、5B_7 1/1024。②3株细胞所产生的McAb均为IgM。③杂交瘤细胞的染色体数,1C_2 82条、2A_3 96条、5B_7 106条。④用McAb作抗原定位,均结合于伊氏锥虫虫体表面。⑤McAb与伊氏锥虫表膜以外的其它抗原成分反应较弱,与锥虫属以外的病原体不发生反应,与泰氏锥虫、路氏锥虫有部分交叉反应。⑥3株McAb对虫体均无抑制作用。     

产生抗羊种布氏杆菌单克隆抗体的有效抗原成分的检定

■用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳和间接酶联免疫法证明,前所获得的抗羊型布鲁氏菌M_(28)菌种杂交瘤细胞株M_(28)1D_2C_1所分泌的单克隆抗体McAb),只与羊型布鲁氏菌M_(28)、M_3和Y_(90)菌体分子量为20,000的蛋白质组分间发生反应,它是产生McAb的有效抗原成分。     

猪瘟单克隆抗体的制备及ACI-ELISA检测猪瘟病毒的研究

本研究用猪瘟石门毒(CSFV-Shimen)免疫BALB/C小鼠,按常规单克隆抗体(McAb)技术方法制作,最终获得4株McAb,分别命名为AC9、CF8、DG5和EC9,4株McAb与基因工程CSFV E2蛋白反应结果表明:AC9、CF8和EC9是抗CS-FV E2蛋白的McAb.用AC9和CF8McAb对CSFV进行抗原捕获间接ELJSA试验(ACI-ELISA),通过一元McAb和二元McAb CAI-ELISA试验的比较,结果表明AC9与CF8两种McAb有协同作用,其捕获CSFV的能力比一元McAb显著提高.方阵试验结果表明:McAb和血清多抗(PcAb)的最佳工作稀释度分别为1:400和1:200.特异性试验和敏感性试验结果显示本法特异性强,敏感性高.最后用ACI-ELISA与PCR对30份病料的检测结果比较,表明ACI-ELISA与PCR检测结果相符.上述结果说明本研究所获得AC9和CF8可用作猪瘟诊断试剂盒的研制,是检测CSFV的有效方法.     

应用单克隆抗体-ELISA检测弓形体循环抗原及免疫复合物的有关因素

本文对 McAb-ELISA 检测弓形体 CAg 及 CIC 的有关因素进行了研究.结果表明:(1)用 McAb 包被液致敏反应板的效果,碳酸盐缓冲液(pH9.6)优于磷酸盐缓冲液(pH7.4).(2)纯化的 McAb 及 McAb-HRP 冷藏贮存,一年内对 FLISA 的检测效果无影响.但 McAb 致敏的反应板只能冷藏一个月.(3)McAb 致敏反应板时,置37℃温育2小时的检测效果似较冰箱过夜为优.(4)普通血清、灭活血清及滤纸血的 ELISA 结果,均无明显差别.(5)检测 CAg 的血清及酶结合的孵育方法可采用 ELISA一步法,而检测 CIC 则必须采用常规二步法.     

猪瘟病毒单克隆抗体的研制和应用Ⅰ.抗猪瘟兔化弱毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以聚乙二醇(PEG,MW6000)沉淀法部分纯化的猪瘟兔化弱毒中国株(SFV-C)免疫BALB/C小鼠,取其脾脏制备脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA检测和有限稀释法克隆化筛选出9株对SFV特异的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞。它们产生的McAb仅对SFV-C株发生特异性反应,而与SFV-S及BV DV Oregon株不发生反应.相加试验表明,9个McAb分别针对不同的抗原决定簇。所有的McAb均不具有沉淀反应特性。     

施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的表达及单克隆抗体制备

为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳(N)蛋白,并制备其单抗(McAb),本研究在SBV-N基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签后,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac~(TM)1中,构建重组供体质粒pFastBac-His-SBV-N。将pFastBac-His-SBV-N转化DH10Bac E.coli,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-His-SBV-N。将rBacmid-His-SBV-N转染Sf9昆虫细胞制备表达His-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒,借助Ni-NTA琼脂糖纯化重组杆状病毒感染Sf9细胞中的His-SBV-N蛋白。以纯化的HisSBV-N免疫BALB/c小鼠制备McAb,利用ELISA叠加试验检测McAb抗原识别位点的异同,并采用高碘酸钠法对识别不同抗原表位的McAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。最终获得了4株识别不同抗原表位的McAb(2A11、2E1、4H11和6E12)并进行了HRP标记;亚型鉴定表明,2A11为IgG1亚型,2E1、4H11和6E12均为IgG2b亚型;间接免疫荧光试验证实,4株McAb均能够识别稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系;Western blot进一步表明,HRP标记的4株McAb均与His-SBV-N蛋白发生特异性反应。His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。     

新城疫病毒单克隆抗体的研究和应用 Ⅰ.抗新城疫病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以差速离心和密度梯度离心法纯化的新城疫病毒(NDV)F_(48)E_6株免疫接种 BALB/C 小鼠,取其脾脏制备脾细胞,与 SP2/0骨髓瘤细胞融合,经用 ELISA 检测和有限稀释法克隆化,筛选出3株对 NDV 特异的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞。其产生的 McAb 仅与 NDV 发生特异性反应。3个 McAb 分别属 IgG_1和 IgG_3,所有McAb 均不具有沉淀反应特性.     

相思子毒素-α单克隆抗体的制备与鉴定

用含1%甲醛的磷酸盐缓冲液对相思子毒素-a(abrin-a)减毒处理制备类毒素,以类毒素为免疫抗原分4次免疫3只BALB/c小鼠.采用聚乙二醇(PEG)法,取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选分泌抗abrin-a的单克隆抗体(MeAb)杂交瘤细胞株.将阳性细胞株接种BAI.B/c小鼠制备McAb腹水,根据亚类鉴定结果,分别采用蛋白A或蛋白G亲和层析柱纯化腹水,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测McAb特异性,Western-blot法分析McAb抗原识别位点.结果获得1G5、3C2和4G1共3株McAb杂交瘤细胞株,均为抗abrin-a的特异性McAb,与相思子凝集素、蓖麻毒素(ricin)和蓖麻凝集素均无交叉反应,其中4G1为特异性结合abrin-a A链的MCAb,1G5和3C2两株为特异性结合abrin-a B链的MCAb;制备的MCAb可用于abrin-a含量的检测.     

分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将用犬细小病毒(CPV)免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇作用下融合,用血凝抑制试验(HI)筛选,以有限稀释法克隆3次,得到6株分泌抗CPV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,其中4株分泌IgG_1,2株分泌IgM;6株杂交瘤细胞染色体数目介于96—103之间;在半年传代期间(45代),均能稳定地分泌McAb。将杂交瘤细胞注射BALB/C小鼠诱生腹水,其HI效价介于1:128—1:512之间,置-20℃保存1年,其效价不变。用交又HI法对2株单克隆抗体作特异性分析,该McAb只特异地与CPV发生反应,而不与猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)、水貂肠炎病毒(MEV)发生反应。     

分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

按katendel氏法用伊氏锥虫JG株制备全虫抗原,以其免疫BALB/C小鼠。以50％PEG(MW4000,pH8.0)作融合剂。使免疫鼠脾细胞与S P2/0 Ag14(简称S P2/0)骨髓瘤细胞融合。经系统筛选和克隆化,建立了9个分泌抗伊氏锥虫抗体的杂交瘤细胞株。他们分泌的McAb,4株为IgG1、1株为IgG3、另4株为IgM。9株McAb在琼脂免疫双扩散试验中均不形成沉淀线。用ELISA检测,这些细胞系培养上清和腹水与同源伊氏锥虫虫株抗原的滴度分别为1:64-1:1024和1:6.4×103-1:6.4×105;与泰氏锥虫和弓形虫抗原则全为阴性。用2个异源伊氏傩虫虫株抗原检测时,8株无任何交叉反应,8株与2个异源株均有交叉反应,另3株则只与1个异源株有交叉反应。用增值反应检查了5株IgG类McAb识别抗原决定簇的特异性,除2株共同识别一种抗原决定簇外,另8株各自识别不同的抗原决定簇。     

空肠弯曲菌共同抗原单克隆抗体的研制及其在细菌检验中的应用 Ⅱ.杂交瘤细胞株的建立及特性鉴定

应用B-淋巴细胞杂交瘤技术,建立了5株稳定分泌抗空肠弯曲菌共同抗原(CA)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(4A7,9D6、9C2、11A1、11D4)。在5株杂交瘤分泌的McAb中,有4株(4A7、9D6、11A1、11D4)针对CA中的耐热抗原成分,对其中4A7、9D6两株分泌的McAb进行免疫印迹分析表明,其与CA中大约为7.7×104u的蛋白移行带出现特异反应;一株(9C2)针对CA中的不耐热抗原成分。对杂交瘤细胞的核型分析表明,其染色体数在93-108之间。体外传代4个月,仍保持稳定分泌抗体的特性。这种McAb具有较强的特异性,除与幽门弯曲菌出现弱阳性反应外,与参试的其它31种非弯曲菌属的细菌均为阴性反应。对不同地区、不同来源的516株空肠弯曲菌的鉴定表明,制备的McAb与现有空肠弯曲菌均出现阳性反应,与常规鉴定法的符合率为100％。     

鸡马立克氏病病毒(MDV)单克隆抗体(McAb)的研究——Ⅰ.抗血清Ⅰ型MDV-McAb的制备及其主要特性的研究

将MDV京-1株强毒高温致弱毒株(B-1/at)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物经冻融、超声波裂解和差速离心制成粗提高毒抗原,免疫6～8周龄雌性BALB/C小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,融合率为66％。用间接免疫荧光(IFA)法和间接ELISA法进行筛选,结果阳性率为25％,特异性阳性率为10.7％。通过有限稀释法克隆出D_(11)~3、D_(12)~3、和H_9~3三个分泌抗血清Ⅰ型MDV的McAb杂交瘤细胞株,其核内染色体数D_(11)~3为103±6条,D_(12)~3为96±6条,分泌的抗体均为IgG_1,k链。琼脂扩散试验(AGP)表明,无论有无聚乙二醇(PEG6000)存在,这些McAb均不产生特异性沉淀线,其IFA阳性反应能被特异性阳性血清阻断,经IFA、ELISA试验、IFA吸收试验和IFA、ELISA阻断试验等证明,这些McAb只与血清Ⅰ型MDV反应,不能与血清Ⅱ型MDV、血清Ⅲ型HVT和鸡的多种其它病毒发生交叉反应,也不与猪伪狂犬病病毒(Prv)双城株发生交叉反应,D_(12)~2株McAb有较明显的中和活性。经体内、外连续传代和冻存、复苏,两株细胞的分泌抗体能力稳定,     

应用单克隆抗体检查伊氏锥虫抗原变异

用广西骡株伊氏锥虫可溶性抗原免疫的BALB/C小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP_2/O)融合,获得了在ELISA中能与广西骡株伊氏锥虫可溶性变异表面糖蛋白反应的2个分泌IgG_1的单克隆抗体(McAb)。用McAb于ELISA抑制试验对四份不同期的广西骡株伊氏锥虫阳性血清的抗体成分进行了分析,结果四份锥虫阳性血清对于McAb与相应抗原决定簇的结合均未出现明显的抑制作用。表明血清样本间很少或完全没有与McAb相类似的抗体。这证明伊氏锥虫存在多个血清型亦即变异抗原型。     

马立克氏病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以马立克氏病毒814株(MDV-814)作为免疫用抗原,建立了2个MDV特异性单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株—4A6、3D7。鉴定结果表明;两株细胞所分泌的McAb均为IgM类免疫球蛋白,具有MDVⅠ型病毒特异性,无中和反应特性和沉淀反应特性。利用两种McAb对国内标准强毒MDV-京1株进行鉴定,肯定其为MDV-Ⅰ型毒株。     

单克隆抗体间接免疫荧光检测猪瘟病毒方法的建立

以作者制备的抗猪瘟病毒单克隆抗体(anti-CSFV McAb)为一抗、荧光素标记羊抗小鼠IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立检测猪瘟病毒抗原的间接免疫荧光(IFA)检测方法。确定IFA最佳工作条件:CSFV最佳接种浓度和培养条件为CSFV 10-3倍稀释后接种PK15细胞,37℃5%CO2恒温箱中培养36 h;McAb最适工作浓度为1∶1 000倍稀释;荧光素标记的羊抗小鼠IgG荧光抗体的最适工作浓度为1∶50倍稀释。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法检测CSFV感染PK15细胞为阳性,而检测伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)感染PK15细胞均为阴性。结果表明,建立的检测细胞培养中CSFV抗原的IFA检测方法具有敏感特异、简便快速等优点,可用于CSFV感染的实验室诊断及CSFV在感染细胞中的定位和动态分布研究。     

分泌抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将猪细小病毒(PPV)免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP_2/O细胞在聚乙二醇作用下融合,用血凝抑制试验(HI)筛选,以有限稀释法克隆3次,得到5株分泌抗PPV单克隆抗体(McAb),选择抗体分泌较高的4F_4、A_4或E_8进行较详细的研究,结果表明,其核内染色体数为93和87,抗体属性为IgG_1,其中1株为K轻链,用交叉HI法对2株McAb作特异性分析,该McAb只特异地与PPV发生反应,而不与日本乙型脑炎(JEV)、犬细小病毒(CPV-b)发生反应,将其中3株杂交瘤细胞注射BALB/C小鼠,抗体HI效价介于1:256～1:10240之间。