空肠弯曲菌共同抗原单克隆抗体的研制及其在细菌检验中的应用 Ⅱ.杂交瘤细胞株的建立及特性鉴定

应用B-淋巴细胞杂交瘤技术,建立了5株稳定分泌抗空肠弯曲菌共同抗原(CA)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(4A7,9D6、9C2、11A1、11D4)。在5株杂交瘤分泌的McAb中,有4株(4A7、9D6、11A1、11D4)针对CA中的耐热抗原成分,对其中4A7、9D6两株分泌的McAb进行免疫印迹分析表明,其与CA中大约为7.7×104u的蛋白移行带出现特异反应;一株(9C2)针对CA中的不耐热抗原成分。对杂交瘤细胞的核型分析表明,其染色体数在93-108之间。体外传代4个月,仍保持稳定分泌抗体的特性。这种McAb具有较强的特异性,除与幽门弯曲菌出现弱阳性反应外,与参试的其它31种非弯曲菌属的细菌均为阴性反应。对不同地区、不同来源的516株空肠弯曲菌的鉴定表明,制备的McAb与现有空肠弯曲菌均出现阳性反应,与常规鉴定法的符合率为100％。     

大肠杆菌K_(88ac)与LT(A~-B~ )抗原基因质粒在猪霍乱沙门氏菌弱毒株中的表达

应用细菌质粒转化技术,将大肠杆菌K_(?)与LT(A~-B~ )抗原基因重组质粒转入猪霍乱沙门氏菌弱毒菌苗株中.对获得的其中8个转化子进行鉴定的结果表明,转化的细菌仍保持沙门氏菌的形态、生化及抗原特性,同时可稳定地表达K(?)和LT-B两种抗原.用微量间接血凝试验、抗甘露糖豚鼠红细胞凝集试验(MRHA)、ELISA等对转化菌表达的K(?)抗原进行了测定,用间接免疫溶血试验对其表达的LT-B抗原进行了测定.结果,这两种抗原在转化的细菌中均可高效表达.电镜下观察,转化的细菌在其表面形成菌毛样结构.这种转化细菌表现出猪霍乱沙门氏菌与产肠毒素性大肠杆菌的两种抗原特性,为这种双价工程菌苗的研制提供了有价值的候选菌株.本研究结果还表明,猪霍乱沙门氏菌弱毒菌苗株可作为基因转化的有效受体菌.     

抗补体-ELISA及其在动物传染病诊断中的应用

应用菊糖和酵母多糖试剂从豚鼠新鲜血清中提取补体C_3,制成菊糖—C_3和酵母多糖—C_3复合物后,以其分别免疫家兔,制备了抗C_3抗血清,经提纯并用HRP标记后,建立了抗补体—ELISA工作程序.通过对8种动物、18个类别的347份血清的检测表明,除抗空肠弯曲菌和獭兔军团菌阳性血清不发生阳性反应外,其余血清均与常规检测法有较好的符合率.     

应用McAb·BA-ELISA快速检测动物源空肠弯杆菌的研究

应用抗空肠弯杆菌共同抗原的单克隆抗体,建立了快速检测动物源空肠弯杆菌的 BA-ELISA 程序。此程序可检出每 ml 含5个空肠弯杆菌24小时增菌培养物或每ml 含3.2×10~4个空肠弯杆菌纯培养物,不与金黄色葡萄球菌等16种对照菌及混合菌液发生交叉反应。用其对雉鸡等10种动物456份肛拭粪便标本进行检测,总阳性率为45.5%,与常规分离鉴定法的阳性符合率为99.1%.敏感性为99.2%.特异性为100%。统计学分析表明,所建立的 BA-ELISA 检测程序与常规分离鉴定法间具有极显著的一致性(p<0.01),能使检测时间缩短4～5天.     

强毒小肠结肠耶氏菌生物素标记基因探针的研究

在构建的小肠结肠耶氏菌毒性质粒DNA基因文库pYB1～8与pYP1～6的基础上,筛选出了pYB7和pYP6克隆株.用限制性内切酶Bam HI消化pYB7,Pst消化pYP6,可分离出3.8kb和6.4kb的插入性DNA片段.以这两个基因片段为目的基因,用生物素化dUTP和光敏生物素标记,获得了生物素标记的基因探针.该探针能检出10pg以上的强毒小肠结肠耶氏菌DNA,不与无毒小肠结肠耶氏菌及大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等18种对照菌反应,具有高度的特异性和敏感性.pYB7与pYP6探针对不同血清型及来源的小肠结肠耶氏菌检测,其结果与自凝性试验、依钙试验等结果相符;对小肠结肠耶氏菌强毒株与无毒株检定的准确率为100%.     

重组逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转移与哺乳动物细胞表达

以构建的重组肿瘤坏死因子逆转录病毒载体ｐＺＩＰＴＮＦ ＤＮＡ转染Ｃｏｓ７细胞，获得了ＴＮＦα暂时性表达。采用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法，将ｐＺＩＰＴＮＦ ＤＮＡ导入了单向性逆转录病毒包装细胞ψ２，在Ｇ４１８选择下，克隆出了ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞系。该细胞可产生重组ＴＮＦ逆转录病毒。本研究利用ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞分泌的重组逆转录病毒连续传代感染ψ２或ＰＡ３１７细胞以及病毒交替感染ψ２和ＰＡ３１７细胞，     

应用酶标抗体染色法实验检定空肠弯曲菌

应用酶标抗体染色法检定空肠弯曲菌,具有较高的特异性及敏感性,除金黄色葡萄球菌呈现轻度着染外(可以从形态学上排除),对沙门氏菌等9种杂菌均不发生非特异性染色反应;用以检查空肠弯曲菌纯培养物,敏感性可达400万个菌/ml。对同时接种10个空肠弯曲菌和1亿个杂菌的30h选择性增菌肉汤培养物,酶染色法可准确地检出,而且不受杂菌的干扰。检查47份鸡粪便标本和38株猪源空肠弯曲菌,其结果与常规细菌分离鉴定结果相同。建立的检定空肠弯曲菌的酶标抗体染色法可在2h内完成。     

外周血中CD4+、CD8+T、CD4+CD25+Treg在绵羊接种布鲁氏菌M5-90弱毒疫苗后的动态变化

为研究绵羊接种布鲁氏菌弱毒M5-90株后外周血中CD4+、CD8+T、CD4+CD25+Treg细胞的动态变化规律,本研究选择11只健康绵羊,每10 d免疫一次,共免疫3次,分别在免疫前、免疫后10d、20 d、30 d利用流式细胞术检测外周血中CD4+、CD8+T、CD4+CD25+Treg淋巴细胞亚群.在免疫后的第20 d,CD4+T、CD8+T细胞百分含量达到最高水平(P＜0.05)后均缓慢下降;在第10d,CD4+CD25+Treg细胞缓慢升高,至20 d、30 d均显著升高(p＜0.05);在布鲁氏菌M5-90疫苗免疫应答过程中CD4+CD25+Treg细胞参与了机体的免疫反应调控,对CD4+T、CD8+T淋巴细胞的比例进行调节,并且维持CD4+/CD8+比值稳定,起到平衡Th1/Th2细胞间反应的作用.     

西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ在昆虫S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的西尼罗病毒(WNV)E domainⅢ基因序列设计1对引物,用PCR方法扩增domainⅢ基因片段,回收目的基因片段定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5,构建重组表达载体pMT-DⅢ。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-DⅢ。提取S2-DⅢ细胞的基因组DNA,用PCR方法检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,研究成功构建了重组表达载体pMT-DⅢ,转染细胞经12mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达WNV E do-mainⅢ蛋白的果蝇S2细胞株。     

旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库的构建及其步筛选

利用差减杂交（减法杂交，subtractive hybridization)技术，以旋毛虫新生幼虫（newborn larvae,NBL)的cDNA作为试验方（tester)，以肌幼虫＋成虫的cDNA作为驱动方（driver)，制备新生幼虫差减cDNA,利用T载体构建NBL差减cDNA文库，获克隆株90个，以试验方的差减cDNA第2次PCR产物＋未差减cDNA为试验方探针，以驱动方的差减cDNA第2次PCR产物＋未差减cDNA为驱动方探针，在NBL差减cDNA文库中初筛NBL的期特异性克隆，获初筛克隆24个。这些初筛斯异性克隆进一步用Southern blot确认鉴定，获直阳性期特异性克隆2个（NBL SSC1，NBL SSC2）.DNASIS以及Blaster的分析结果显示，这2个克隆为旋毛虫的2个新基因，其中NBL SSC1编码糖蛋白，NBL SSC2编码丝氨本蛋白酶，本试验为旋毛虫期特异性基困全长序列的调取，分析，鉴定以及强保护性抗原基因的筛选奠定了基础。