卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI的构建及表达

为构建卵泡抑制素与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因疫苗pEGISI,将pcISI中的乙肝表面抗原(HBsAg)S基因及插入S基因中的抑制素(INH)基因片段酶切回收;PCR扩增pcISI中INH基因片段,调整阅读框,一起融合到pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,构建ISI-EGFP融合表达质粒pEGISI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pEGISI构建成功。将pEGISI转染293T细胞,16h后检测到绿色荧光,48h检测到强烈荧光,说明融合基因在293T细胞获得高表达;ELISA检测证实,表达产物ISI-EGFP融合蛋白具有INH的抗原抗体反应原性。质粒pEGISI的成功构建及表达为抑制素基因免疫的机理及安全性研究奠定了基础。     

TLN-58和hLYZ基因融合表达载体的构建及其细胞毒性研究

为了评价融合表达抗菌肽TLN-58和人溶菌酶hLYZ双基因重组表达质粒的安全性,试验采用基因重组法将TLN-58和hLYZ基因片段克隆至pEGFP-N1载体,利用转染试剂GeneTwin^TW将构建好的重组质粒转染HEK293细胞,RT-PCR验证重组真核质粒在细胞中表达情况;通过DAPI染色、AO/EB染色、CCK-8检测法和流式细胞术测定并分析hLYZ和TLN-58融合基因表达产物的细胞毒性。结果表明:成功构建重组真核质粒pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58,当重组质粒DNA用量为1μg且GeneTwin^TW转染试剂用量为3μL时,转染HEK293细胞24 h,为最佳转染条件,重组质粒可成功表达目的基因;DAPI染色和AO/EB染色显示,转染pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58质粒组细胞凋亡与对照组相比,无显著性差异;CCK-8试验测定细胞相对增殖率(RGR)为50%~74%,显示重组质粒的细胞毒性较小;流式细胞术检测发现重组质粒转染细胞与对照组细胞在G1、G2和S期所占的比例均差异不显著。结果表明,重组质粒的细胞毒性较小且对细胞周期无显著影响,为抗菌肽TLN-58和hLYZ的安全性及抗菌应用奠定了研究基础。     

重组绵羊pEGFP-PRNP质粒构建及真核细胞转染

构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。     

山羊TLR2绿色荧光蛋白融合载体的构建

为了构建在哺乳动物细胞中表达的山羊TLR2绿色荧光蛋白融合载体,试验根据克隆到T载体上的山羊TLR2测序结果,设计1对不含终止子的引物,将山羊TLR2 PCR产物连接到pEGFP-N1载体上,用磷酸钙法转染293T细胞,并在荧光显微镜下观察。结果表明:重组质粒经酶切和测序鉴定正确,且在293T细胞中表达;融合蛋白发出绿色荧光,表明TLR2-EGFP主要分布在细胞膜上。说明试验成功地构建了pEGFP-TLR2-N1绿色荧光蛋白融合载体。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector pEGFP-E5-N1 of Bovine Papillomavirus Type 13 and its Expression in HEK293 Cells

The PCR technology was used to amplify the E5 gene according to the genome sequence of bovine papillomavirus type 13 (BPV-13) Hainan strain with the GenBank accession number KM258443.2.Then it was ligated into pEGFP-N1 vector.The recombinant plasmid pEGFP-E5-N1 was transfected into HEK293 cells with liposomes by transient transfection.The expression of fusion protein was identified by fluorescence microscope, flow cytometry and Western blotting.The results showed that the E5 gene was 135 bp with the 100% homology with the sequence deposited in GenBank.Bright green fluorescence could be seen in HEK293 cells transfected by pEGFP-E5-N1.The expressed fusion protein was about 32 ku.This experiment laid the foundation for further study of the functions of E5 gene in eukaryotic cells.     

牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

基于海口市动物基因工程重点实验室获得的牛乳状瘤病毒13型(BPV-13)基因组序列信息(GenBank登录号:KM258443.2),以基因组为模板,扩增E5基因片段,将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-E5-N1,测序正确后瞬时转染HEK293细胞,应用荧光显微镜、流式细胞仪、Western blotting 鉴定融合蛋白的表达。结果显示,E5片段大小为135 bp;重组质粒pEGFP-E5-N1构建正确;荧光显微镜下观察转染重组质粒pEGFP-E5-N1的HEK293细胞,可见明亮的绿色荧光;流式细胞术分析结果显示,转染重组质粒pEGFP-E5-N1 48 h后,约55.59% 的细胞表达绿色荧光蛋白;Western blotting结果表明,表达的融合蛋白大小约为32 ku。本试验结果为下一步研究E5基因的作用机理奠定了基础。     

鸡RORα真核表达载体的构建及其在MSB1细胞中的表达

为构建鸡维甲酸相关孤核受体α（retinoid acid receptor related orphan receptor α,RORα）的真核表达载体,并检测其在MSB1细胞中的表达效果,本研究参照GenBank中鸡RORα基因序列（登录号：NM_001289887.1）设计特异性引物,从鸡肝脏组织中提取总RNA,经反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,将扩增的特异性RORα基因片段连接pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-RORα,再用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切克隆载体pMD18-T-RORα和真核表达载体pEGFP-N1,将酶切回收的RORα与pEGFP-N1片段进行连接,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-RORα,经PCR、酶切和测序验证准确性后,将其转染MSB1细胞,于转染后48 h荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并采用实时荧光定量PCR检测鸡RORα在MSB1细胞中的表达水平。结果显示,从构建的重组质粒pEGFP-N1-RORα中可扩增出大小约1 600 bp的特异性片段,用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ可切出大小约4 700和1 600 bp的两条带。实时荧光定量PCR结果显示,转染MSB1细胞48 h后,与对照组相比,重组真核表达载体转染组中鸡RORα基因mRNA水平显著增加（P<0.05）。表明本试验成功构建了鸡RORα的真核表达载体,该载体可在MSB1细胞中表达鸡RORα,为进一步研究鸡RORα对MSB1细胞增殖的影响奠定基础。     

禽白血病病毒gp85蛋白在293T细胞中的表达及分析

为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(pEGFP-N1-gp85)的表达情况。结果显示,pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中均匀分布,说明pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达;pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达的蛋白质分子质量约为60 ku。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-gp85,并在293T细胞中获得了表达,为研制ALV-J-gp85 DNA核酸疫苗提供了科学支撑。     

禽流感病毒NS1蛋白亚细胞定位研究

为深入研究NS1蛋白的生物学功能,了解NS1蛋白在哺乳动物细胞中的分布和亚细胞定位情况.采用RT-PCR扩增出禽流感病毒NS1基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,经酶切和测序鉴定后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-NS1经脂质体介导转染293T细胞和Hela细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察NS1在细胞...     

猪白介素4在CHO-K1细胞中的重组表达及生物学活性分析

将猪白介素4(Porcine interleukin4,PIL-4)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pEGFP-PIL-4,利用脂质体法转染CHO-K1细胞,采用荧光显微镜实时观察、RT-PCR和Western-blot分别检测CHO细胞转录表达目的分子的情况,通过MTT法检测所表达蛋白的生物学活性。结果在将重组质粒转染CHO-K1细胞中24、48 h后的均观察到绿色荧光;经G418筛选14~20 d后转染的细胞形成了阳性细胞集落,用RT-PCR扩增出约339 bp的目的基因片段;经Western-blot检测到约为39 000的特异蛋白分子条带,并证明在转染重组质粒的细胞中表达了高生物活性的重组蛋白。     

水牛水通道蛋白8基因克隆及表达分析

In this study, buffalo AQP8 gene was cloned and its eukaryotic expression vector was constructed, the expression pattern of AQP8 gene in buffalo ovary tissue was also assayed. The results showed that the CDS length of cloned buffalo AQP8 gene was 732 bp, and it shared 100% homology of amino acid sequence with cattle and mouse. AQP8 protein was detected in different developmental stages of buffalo follicles, it had significantly higher expression in the secondary follicles than that of in the primordial and the primary follicles (P＜0.05), and it mainly expressed in the granulosa cells of the secondary follicles. Clear EGFP green fluorescent was observed in transfected cell groups with transfection of the pEGFP-N1-AQP8 eukaryotic expression plasmid into HEK293T cells by Lipofectamine^R LTX and PLUS^TM reagent. The above results lay foundation to further investigate the function of AQP8 gene in the buffalo follicle development and granulosa cell apopotosis.     

Construction and Validation of Oct4-EGFP Pluripotent Reporter Vector in Pig

This study aimed to construct Oct4-EGFP pluripotent reporter vector in pig without destroying cells researching the expression pattern of Oct4, thus contributing to early embryonic development and stem cell research.Construct Oct4-EGFP pluripotency reporter vector with the In-Fusion PCR cloning technology, the Oct4 promoter sequence to direct the recombinant vector pEGFP-N1 instead of EGFP original CMV promoter plasmid pEGFP-N1 by Oct4 and liposomal transfection technology, and transfected into livability of porcine fetal fibroblasts cells.The results showed that it had successfully constructed Oct4-EGFP pluripotency reporter vector by PCR and sequencing verified, and initially verified the validity of the carrier in the parthenogenetic blastocysts.After liposomal transfection, 8 genetically modified cells of incorporates pluripotent report carrier with the Oct4-EGFP had been gained by screening and PCR.Thus, the In-Fusion PCR cloning technology could efficiently construct Oct4-EGFP pluripotency reporter vector and obtained transgenic positive cells could lay the foundation for the early development and embryonic stem cell research of pig embryos.     

猪Oct4-EGFP多能性报告载体的构建与验证

本研究旨在构建一套猪Oct4-EGFP多能性报告载体,可在不破坏细胞的前提下研究Oct4的表达规律,从而有利于早期胚胎发育研究及干细胞的研究。试验采用无缝克隆(In-Fusion PCR cloning)技术,将Oct4启动子序列直接重组到pEGFP-N1载体上,用Oct4代替质粒pEGFP-N1中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)原有的CMV启动子构建出Oct4-EGFP报告载体,并用脂质体转染技术转染入大白猪胎儿成纤维细胞中,分析Oct4-EGFP报告载体,表达情况。结果发现,经PCR及测序验证,成功构建了Oct4-EGFP多能性报告载体,并在孤雌囊胚上初步验证了载体的有效性;经过脂质体转染,经筛选及PCR鉴定,获得了8株整合有Oct4-EGFP多能性报告载体的转基因细胞。研究结果表明,运用无缝克隆技术可高效率构建Oct4-EGFP多能性报告载体,且获得的转基因阳性细胞可为猪胚胎早期发育和胚胎干细胞研究奠定技术基础。     

Expression of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) Gene Carried by a Lentiviral Vector RCASBP in DF-1 Cell

To construct a lentiviral vector RCASBP carrying the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene which could be expressed stably in DF-1 cell,EGFP gene was amplified by PCR and then inserted into the lentiviral vector RCASBP after digested with the restriction endonuclease ClaⅠto construct recombinant lentiviral vector RCASBP-EGFP.The recombinant vector was transfected into DF-1 cells by Lipofectamine^TM 2000.Avian leukosis virus (ALV) p27 antigen ELISA test was performed after four passages of the transfected cells and the positive results of ELISA suggested the success rescue of the virus.The expression of EGFP was observed in more than 80 percentages of DF-1 cells under fluorescence microscope.The proviral genome PCR showed EGFP gene carried by the recombinant lentiviral vector RCASBP-EGFP had been integrated into the genome of DF-1 cells.The RCASBP lentiviral-mediated expression system provided a basis for study of the structure and function of ALV genes.     

反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV) p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80%以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中。本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白在Marc-145细胞中的表达

针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明：成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。     

旋毛虫T668基因真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

利用RT-PCR技术从中国河南猪旋毛虫(国际标准虫种编号为ISS534)新生幼虫得到T668基因,并克隆入pEGFP-N1真核表达载体中构建重组质粒,该重组质粒在脂质体介导下转染BHK细胞。EGFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,Western blotting鉴定,细胞裂解液样品中有1条约77 000的条带,可被绿色荧光抗体及猪感染旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,表明成功构建T668-pEGFP-N1真核表达质粒,并在BHK细胞融合表达,表达产物具有抗原性。     

反转录病毒介导的稳定表达HIV-1Gag蛋白和增强型绿色荧光蛋白细胞系的建立

本研究旨在建立中国流行株人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白(Gag)哺乳动物稳定表达细胞系。将HIV-1核心蛋白基因gag和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP依次串联插入反转录病毒载体pFB-neo,构建重组反转录病毒载体pFB-gag-EGFP,并与含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装出的反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP表达,验证HIV-1核心蛋白Gag表达,G418抗性筛选阳性细胞。结果表明,HIV-1核心蛋白Gag和增强型绿色荧光蛋白可在SP2/0细胞中稳定表达,HIV-1核心蛋白gag基因稳定表达细胞系成功建立,为抗AIDS治疗用基因工程制剂及靶向药物的活性检测提供了理想方法。