猪戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其分子流行病学

对已发表的戊型肝炎病毒(HEV)不同基因型毒株全序列进行分析,针对ORF3的保守区设计引物和探针优化建立了HEV荧光RT-PCR检测体系。分析表明该反应体系具有良好的扩增效率、特异性和稳定性,且检测灵敏度比普通RT-PCR方法高10～100倍。利用所建立的荧光定量PCR方法对采集自浙江及其周边上海、江苏等地区规模化猪场的样品以及HEV抗体阳性人血清样品进行了HEV核酸检测。其中,77份人血清样本仅有2份为HEV核酸阳性(2.6%)。而猪粪便样品阳性率则高达20.5%(56/273),且所调查的猪场均存在HEV感染。进一步的分子流行特征分析表明,浙江及周边地区的猪HEV毒株多为基因Ⅳ型,与其他地区的Ⅳ型HEV毒株同源性较高(83.4%～89.5%),但它们之间也存在较多的变异位点。猪源HEV毒株PJ-1则与多数Ⅲ型HEV毒株同源性较高(88%),进化分析也表明其为基因Ⅲ型。人血清样品中检测到的2份HEV毒株Human-1与Human-2与本地区Ⅳ型猪源毒株在分子进化关系上具有很高的亲源性,它们分布于同一分支内,而不构成独立分支。以上分析结果表明浙江及其周边地区猪HEV感染较为广泛,且以基因Ⅳ型毒株为主,但也存在...     

猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

猪链球菌溶血素(SLY)是较早确定的猪链球菌毒力因子之一,具有细胞毒性,在猪链球菌致病过程中发挥重要作用。利用同源重组技术成功构建了猪链球菌2型(SS2)sly基因缺失的突变株SS2-Δsly,缺失株的体外溶血活性消失,对小鼠脑血管内皮细胞的细胞毒性显著低于亲本菌株(P<0.01),但不影响猪链球菌2型在巨噬细胞中的存活。该菌株可以用于研究SS2溶血素在感染细胞中的作用机制。     

GC/MS法研究鸡体内三聚氰胺的残留及代谢规律

研究建立了气相色谱-质谱法(GC/MS)测定鸡体内三聚氰胺残留的方法.样品以10 g/L三氯乙酸溶液提取,Cleanert PCX固相萃取柱净化,50℃水浴中氮气吹干后衍生化.以GC/MS选择99,171,327,342 4个碎片离子进行定性定量分析.三聚氰胺在0.05～2.50 mg/L呈线性(R2为0.999),鸡蛋中3种不同添加浓度0.05,0.10和0.50 mg/kg下三聚氰胺平均回收率分别为84.71%,88.12%,92.62%;相对标准偏差分别为10.57%,7.12%,6.92%;样品中最低检测限(S/N=3)为0.005 mg/kg.采用该方法研究三聚氰胺在鸡体内的代谢机理,结果表明:在较高饲喂浓度(1 000 mg/kg)时,用药后,鸡体内三聚氰胺蓄积量逐渐增加,最高蓄积浓度为16.465 mg/kg,但停药后代谢又非常快.     

单核细胞增生李斯特菌精氨酸脱亚胺酶基因的克隆及原核表达

精氨酸脱亚胺酶(ADI)可能介导单核细胞增生李斯特菌抗酸应激,由arcA基因编码。利用分子克隆技术从单核细胞增生李斯特菌10403S扩增得到ADI基因,测序正确后将其插入pET30a表达载体中,构建该基因的原核表达质粒pET30a-ADI,并转化入大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达。核苷酸序列分析显示,ADI基因的完整开放阅读框为1 233 bp,编码410个氨基酸。SDS-PAGE表明:该基因在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白的分子质量约为52.5 ku。为进一步研究精氨酸脱亚胺酶的活性提供了条件,同时也为探索单核细胞增生李斯特菌抗酸应激的机理奠定了重要的基础。     

中华鳖脾淋巴细胞体外转化的实验条件研究

为确定MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测中华鳖脾淋巴细胞体外转化的条件,对脾淋巴细胞浓度和培养时间、丝裂原种类和浓度等影响因素进行优化.结果显示:2×106 cells.mL-1的脾淋巴细胞用10μg·mL-1Con A(伴刀豆蛋白A)诱导培养120 h或用5μg.mL-1 PHA(植物血凝素)诱导培养144 h,能获得良好的检测效果.研究表明,采用MTT法测定中华鳖脾淋巴细胞体外转化方便可行,可为中华鳖脾淋巴细胞体外转化方面的研究提供参考.     

瑞士乳酸杆菌HZ521株的分子鉴定及其部分生物学特性研究

根据GenBank中乳酸杆菌16 S～23 S rRNA基因间沉默区序列设计引物,进一步鏊定猪源乳酸杆菌分离株HZ521;并通过体外试验,以嗜酸乳酸杆菌ATCC 4356为参考菌株,探讨HZ521株的益生素作用.部分16 S～23 S rRNA基因序列同源性分析结果表明,该分离株属于瑞士乳酸杆菌.HZ521株具有较强的产酸能力,能耐受强酸,对Hela细胞的黏附率为87.2%,显著高于ATCC 4356株(P<0.01).表明瑞士乳酸杆菌HZ521株具有益生素特性,可作为肠道益生素的候选菌株.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(He-PRRSV)基因组序列设计1对特异性引物,建立一种基于SYBR Green I实时PCR检测HP-PRRSV的方法.结果表明,该方法能够检测到HP-RRSV的存在,不与其它猪源病毒发生非特异性反应,标准曲线线性范围为1011拷贝/反应～102拷贝/反应.与常规PCR方法相比,两者的符合率100%.该方法具有快速、简便、敏感等优点,具有重要的实用价值.     

减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗诱导对新城疫病毒的免疫保护

探讨了以减毒鼠伤寒沙门氏茵为栽体传递新城疫病毒DNA疫苗的安全性、免疫原性和可行性。将含新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pcDNA3-F的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株(ZJ111／pcD-NA3一F菌株)，以10^8CFU进行首免，2周后二免，三免后4周攻击强毒株F48E9，观察其安全性和免疫原性，同时设只含空载体pcDNA3的ZJ111／pcDNA3菌株对照及口服PBS对照。结果表明：重组ZJ111／pcDNA3-F菌株具有良好的安全性。对强毒株攻击的保护率达64．7％。重组ZJ111／pcDNA3-F菌株不仅能诱导雏鸡产生NDVELISA抗体，而且诱导产生的法氏囊B淋巴细胞和胸腺T淋巴细胞增殖反应显著高于ZJ111／pcDNA3时照组。这些结果提示，减毒沙门氏菌为载体不仅可直接将NDVF基因呈递给鸡体细胞进行表达，产生抗NDV的体液免疫，而且还可诱导细胞免疫应答。     

猪链球菌2型JX分离株的生物学特性

从临床表现为脑膜炎、关节炎及败血症的发病猪分离到2株细菌，分别命名为JX02和JX03，经鉴定其形态、染色及培养特性均符合链球菌的特点，具α或β溶血，生化试验结果不稳定。用猪链球菌2型、1型和9型抗血清进行凝集试验，结果2株菌均能与猪链球2型抗血清凝集，其中1株菌对小鼠和家兔均有致病性，另1株菌只能致死家兔。PCR均能扩增2株菌的主要毒力因子基因。表明发病猪的病原不同于以往的C群链球菌，不是马链球菌兽疫亚种，而是属于R群的猪链球菌。     

兽医微生物学学科发展

兽医微生物学主要研究病原微生物的特征及其与动物疾病之间的关系,并应用微生物学、分子生物学和免疫学知识与技术来诊断和防治动物疫病以及人兽共患病,在保障畜牧生产发展、动物源性食品安全和人类健康方面起着重要作用.近20年来,伴随着分子和细胞生物学理论和技术的飞速发展,兽医微生物学在基础研究、技术创新和应用方面也取得了重要进展.