红螯螯虾卵黄蛋白原VWD结构域的原核表达及纯化

【目的】原核表达红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）卵黄蛋白原（Vg）VWD结构域,为深入开展Vg的生物学功能研究和开发相应的生物活性物质提供技术支持,也为改进虾类养殖催熟及获取高质量后代打下基础。【方法】在GenBank中搜索红螯螯虾卵Vg的mRNA序列（AF306784.1）及查找其VWD结构域（2345~2491 aa）,采用ExPASyProtParam、ProtScale、InterProscan及TMHMM等在线软件进行生物信息学分析及理论评估,结合大肠杆菌密码子偏好优化原始VWD氨基酸序列;然后通过全基因合成获得目的基因,连接至载体pET-28a构建重组质粒pET-28a-VWD,挑取阳性克隆转化大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞及采用IPTG进行诱导表达,并以10% SDS-PAGE电泳和Western blotting检测诱导表达的融合蛋白。【结果】红螯螯虾VWD结构域相对分子量为19692.11 Da,理论等电点（pI）为9.35,分子式为C₈₅₅H₁₃₃₄N₂₅₈O₂₆₁S₉,属于不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域。延伸链和无规则卷曲是红螯螯虾VWD结构域二级结构的主要元件,其中,α-螺旋占7.73%,β-转角占10.50%,延伸链占35.91%,无规则卷曲占45.86%。重组质粒pET-28a-VWD经大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞诱导表达即获得融合蛋白VWD,以2 mol/L盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析纯化及复性后,10% SDS-PAGE电泳和Western blotting检测均在蛋白相对分子量约20.0 kD处出现1条清晰的特异性条带,融合蛋白VWD表达形式以包涵体为主。融合蛋白VWD在BL21（λDE3）感受态细胞中高效表达的最佳诱导条件:当单克隆菌液OD_{600 nm}达0.6时添加0.5 mmol/L IPTG,置于20℃下诱导培养16 h。纯化后的融合蛋白VWD浓度为1.32 mg/mL。【结论】通过全基因合成获得的优化红螯螯虾VWD基因能在大肠杆菌BL21（λDE3）感受态细胞中诱导表达出以包涵体为主要形式的融合蛋白,经盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析柱纯化及复性即可获得高纯度的活性VWD蛋白,为后续开展红螯螯虾Vg生物学功能研究及开发相应的生物活性物质提供技术支持。     

全州禾花鲤鳞片下层组织的结构及全长转录组分析

为研究全州禾花鲤(Cyprinus carpio var. Quanzhounensis)皮肤组织结构和转录组差异、丰富鲤鱼皮肤转录组信息，选用建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)和全州禾花鲤鳞片下层组织，利用透射电镜观察结构差异，发现禾花鲤与建鲤相比组织缺乏层叠排列的鸟嘌呤结晶且黑色素颗粒增多；利用牛津纳米孔(ONT)测序技术分析了转录组特征，获得高质量数据18.49 Gb，识别为全长序列17 182 183条，检测出可变剪接(AS)事件3 075个、可变多聚腺苷酸化(APA) 57 624个，预测新基因编码区序列15 615个、长链非编码RNA (lncRNA) 771个。其中，可变剪接事件中外显子跳跃、内含子保留数量在种间差异极显著(P<0.01)，具有5个多聚腺苷酸化位点的转录本数量在种间差异极显著(P<0.01)，表明可变剪接和多聚腺苷酸化参与性状形成相关的调控过程；共筛选出差异表达转录本841个，KEGG通路分析表明其在细胞外基质–受体相互作用、粘着斑等通路富集，GO分析发现其在细胞外隙、转录因子复合体、整合素复合物等词条显著富集，且最显著富集的KEGG通路和GO词条均与细胞外基质紧密关联，推测这些转录调控的变化可能导致皮肤细胞外基质的组成、密度和构象变化。后续研究应更多关注鸟嘌呤结晶缺失造成的皮肤性状变化，有助于全州禾花鲤种质资源开发与利用。     

猪丁型冠状病毒N基因原核表达及多克隆抗体制备

旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N蛋白的抗原性，为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，经诱导表达获得重组N蛋白，纯化后经Western blot方法检测其反应原性，免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法)。结果显示：重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量，该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达；Western blot结果显示，纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合，具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性。提示：PDCoV N蛋白抗原性好，可作为诊断试剂盒的候选抗原。     

全州禾花鲤皮肤转录组特征分析

为探究全州禾花鲤乌褐色、半透明的经济体色性状，发掘全州禾花鲤的皮肤基因信息，以全州禾花鲤的皮肤组织为研究对象，利用高通量测序技术进行转录组比较分析。结果显示，全州禾花鲤和建鲤（对照）的皮肤组织转录组测序获得37 066 778～58 708 166条clean reads,Q30在94.96%以上，GC碱基比例在51.00%左右；发现新基因10 537个，检测出单核苷酸多态性（SNP）位点1 278 906个、插入缺失（InDel）位点80 238个。筛选显著差异基因11 717个，其中上调基因5 133个，下调基因6 584个。GO注释到56个二级分类，显著富集的GO条目127个，主要集中在生物学过程和细胞组分；KEGG分析获得显著富集通路60个；网络分析结果显示，以代谢途径（Metabolic pathways）、p53信号通路（p53 signaling pathway）和细胞周期（Cell cycle）通路作为网络核心，与众多KEGG通路关联且相对独立。     

副溶血弧菌与嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种可精准、快捷鉴别检测副溶血弧菌(VP)及嗜水气单胞菌(AH)的方法，根据GenBank公布的VP Tlh基因及AH aerA基因保守区序列，设计合成两对特异性引物，通过优化反应体系及反应程序，成功建立了一种可同时检测VP与AH的双重PCR方法，并开展了特异性及敏感性试验。结果显示：VP Tlh和AH aerA基因扩增条带大小分别为500、760 bp；反应体系中Tlh与aerA基因引物最优浓度分别为7.5、10.0nmol/L，反应程序中最佳退火温度为56.8℃；该方法对VP、AH的最低可检出细菌浓度均为1.2×10³ CFU/mL；对地衣芽孢杆菌、微小杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡阳芽孢杆菌、普通变形杆菌、维氏气单胞菌、布氏柠檬酸杆菌、豚鼠气单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、简氏气单胞菌等其他非目标菌均无交叉反应，仅对VP和AH呈特异性阳性扩增。综上，本研究建立了一种可快速鉴别诊断VP、AH的双重PCR检测方法，其特异性强、灵敏度高，可为VP、AH等细菌性病原引发的水生动物疫病的快速诊断、监测及有效防控提供技术支持。     

JEV、PRRSV、PPV及PRV多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能快速鉴别猪日本脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的准确、高效的多重常规PCR检测方法，针对JEV、PRRSV、PPV、PRV基因保守区域合成特异性引物，优化后获得最优反应条件，对该方法特异性、敏感性、重复性进行了测定，并应用该方法对临床样品进行初步应用。结果显示，该方法对JEV、PRRSV、PPV、PRV可进行特异性扩增，对混合阳性质粒检测下限达2×10⁶ copies/μL,对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒等相关病毒均无扩增，且重复性良好。用该方法检测51份2021年采集的广西区内组织样品，检出JEV、PRRSV、PPV、PRV阳性率分别为7.84%、50.98%、5.88%、23.53%,且存在多重混合感染的情况。所建立的多重PCR方法具有良好的特异性、敏感性及重复性，可应用于临床常见猪繁殖障碍性病毒病的快速诊断和监测预警，为猪繁殖障碍性病毒病提供了诊断技术支持。