规模化畜禽养殖场粪便中多重耐药菌分离鉴定及其耐药特征

为了解禽畜粪便中多重耐药菌的污染特征,本研究对鸡粪、牛粪、猪粪和有机肥这4种不同样品中多重耐药菌进行了计数分析,并对不同来源的多重耐药菌株进行了分离和纯化,进一步开展了基于16S rDNA序列比对的分子生物学鉴定以确定其种属地位,以及基于药敏试验的耐药性特征分析。结果表明:不同养殖动物粪便中四环素、恩诺沙星、磺胺甲恶唑和泰乐菌素4种抗生素多重耐药菌的绝对数量和相对数量排序均为鸡粪>猪粪>牛粪,粪源有机肥中可培养的多重耐药菌的绝对数量和相对数量在堆肥后均有所下降。通过对耐药菌株鉴定和分类学分析,发现禽畜粪便中多耐药菌的菌门集中分布在Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria,多重耐药菌的优势菌属为Escherichia、Corynebacterium、Kurthia;而有机肥样品中多重耐药菌的优势菌属为Staphylococcus、Glutamicibacter。菌株的药敏试验表明,3类动物粪污中的多重耐药菌都对红霉素、四环素有着较高的耐药率,均高于80%,而对阿米卡星这种抗生素表现出较好的敏感性,其耐药率低于30%。通过对Ⅰ、Ⅱ类整合子基因盒的扩增,发现PCR产物的大小从0.8 kb到1.8 kb不等,基因盒ad A2、dfr A17、dfr A1及sat2在养殖场粪污中检出率均较高。     

Isolation and characterization of antimicrobial-resistant Escherichia coli from national horse racetracks and private horse-riding courses in Korea

Limited information is available regarding horse-associated antimicrobial resistant (AR) Escherichia (E.) coli. This study was designed to evaluate the frequency and characterize the pattern of AR E. coli from healthy horse-associated samples. A total of 143 E. coli (4.6%) were isolated from 3,078 samples collected from three national racetracks and 14 private horse-riding courses in Korea. Thirty of the E. coli isolates (21%) showed antimicrobial resistance to at least one antimicrobial agent, and four of the AR E. coli (13.3%) were defined as multi-drug resistance. Most of the AR E. coli harbored AR genes corresponding to their antimicrobial resistance phenotypes. Four of the AR E. coli carried class 1 integrase gene (intI1), a gene associated with multi-drug resistance. Pulsed-field gel electrophoretic analysis showed no genetic relatedness among AR E. coli isolated from different facilities; however, cross-transmissions between horses or horses and environments were detected in two facilities. Although cross-transmission of AR E. coli in horses and their environments was generally low, our study suggests a risk of transmission of AR bacteria between horses and humans. Further studies are needed to evaluate the risk of possible transmission of horse-associated AR bacteria to human communities through horse riders and horse-care workers.     

整合子与细菌多重耐药性

细菌的多重耐药已成为临床治疗的难题,其耐药机制、耐药基因的传播与转移是近年来研究的热点。近来研究表明,细菌中存在一种能捕获和表达基因的遗传单位———整合子在细菌获得耐药机制中起了重要作用。整合子编码一个整合酶负责基因盒在重组位点attⅠ和attC上的插入及切除,同时整合子也提供一个启动子(Pant)负责基因盒耐药基因的表达。整合子携带着重组的基因盒插入到转座子或接合质粒中,在不同的细菌间运动而传播耐药性,同时一个整合子可以捕获多个基因盒,对细菌多重耐药的形成起重要作用。现就整合子的结构、类型、基因盒的种类与表达及其与细菌多重耐药性的有关研究进行综述。     

大肠埃希菌Ⅰ类整合子与多重耐药的相关性分析

采用从粪便中分离并鉴定出的40株鸡源大肠埃希氏菌,用K-B法测定大肠杆菌多重耐药性,通过PCR法扩增Ⅰ类整合子,电泳检测扩增产物。结果表明,40株大肠杆菌对10类18种抗菌药物的耐药率,最高为S,C,SMX,SXT 100%,最低为PB,CTX 0%,多重耐药率(耐3种以上药物)为100%。Ⅰ类整合子阳性菌株35株,阳性率87.5%。Ⅰ类整合子对大肠杆菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用,应加强基因水平耐药监测。     

猪源多重耐药大肠杆菌中整合子的检测

为了解猪源多重耐药大肠杆菌中整合子的流行状况和分子特性,分析整合子在细菌多重耐药中的作用,采用PCR方法检测75株多重耐药大肠杆菌中整合酶基因和整合子基因盒。结果显示,猪源大肠杆菌Ⅰ型整合子流行普遍,75株猪源大肠杆菌中检出Ⅰ类整合子56株,检出率为74.7%;检出Ⅱ类整合子4株,检出率5.3%;未检出Ⅲ类整合子。共检出5种Ⅰ型整合子,各种Ⅰ型整合子整合不同种类、不同数目的耐药基因盒。这表明Ⅰ型整合子对细菌多重抗药性的产生和传播起着重要作用,整合子是介导细菌多重耐药性的重要分子机制。     

E-coli整合酶检测方法研究

通过检测整合酶确定多重耐药大肠杆菌是否含有整合子。试验采用梯度PCR方法确定扩增整合酶最佳温度,以该温度扩增247株菌整合酶,并对PCR产物鉴定测序,确定整合酶类型。结果表明,247株菌中有158株菌扩增出了Ⅰ型整合酶,13株菌扩增出了Ⅱ型整合酶,总共有171株菌扩增出了整合酶基因。表明可通过PCR扩增整合酶的方法监测多重耐药大肠杆菌携带整合子的情况。     

猪-鱼复合养殖模式中气单胞菌I类整合子的流行情况及其耐药特征

为了解广东地区猪-鱼复合养殖模式下气单胞菌整合子流行情况及其耐药特征,从广东省5个不同猪-鱼复合养殖场采集分离猪粪、鱼、池塘水及池塘底泥的气单胞菌共317株,通过微量二倍稀释法测定其对20种药物的敏感性;PCR扩增Ⅰ类整合子整合酶基因intI1,并分析其基因盒阵列结构。结果表明,317株气单胞菌对20种药物耐药程度不一,氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶、萘啶酸的耐药率相对较高。intI1的检出率为15.77%,鱼源和猪源的整合子检出率高于环境源。整合子阳性菌对测试的12种药物的耐药率显著高于阴性菌,且表现为多重耐药;50个Ⅰ类整合子共检测到16种耐药基因盒,包括了编码氨基糖苷类耐药基因aadA1、aadA2、aac6-Ⅱ、aacA4,甲氧苄啶耐药基因drfA1、dfrA12、dfrA15、dfrA17、dfrB4,β内酰胺类耐药基因bla_(OXA-10)、bla_(OXA-21),氯霉素耐药基因catB3、catB8,利福平耐药基因arr2、arr3以及质粒介导的喹诺酮类耐药基因aac(6')-Ib-cr。携带了不同类耐药基因盒的整合子阳性菌还表现出所对应的对甲氧苄啶、链霉素、氯霉素类等的耐药表型,由此推测整合子的存在与细菌的多重耐药密切相关。研究表明,I类整合子分布于广东地区猪-鱼复合养殖模式下不同来源气单胞菌,并介导细菌对多种抗菌药物耐药。有必要开展畜禽-鱼复合养殖模式下细菌耐药性的传播机制研究,为水产养殖合理用药提供依据。     

辽宁地区猪源大肠埃希菌整合子携带情况调查与分析

查明辽宁地区整合子在猪源大肠埃希菌中的分布及整合子携带耐药基因盒的种类,可为该病的综合防控提供科学依据。本研究利用整合酶基因PCR扩增法检测整合子,并对整合子可变区进行扩增测序。结果表明,71.43%(40/56)的菌株为Ⅰ类整合子阳性,1.79%(1/56)的菌株同时为Ⅰ类和Ⅱ类整合子阳性,未检测到Ⅲ类整合子;87.8%(36/41)的菌株表现为Ⅰ类整合子可变区扩增阳性,扩增产物大小在116bp~2 307bp之间,100%(1/1)菌株表现为Ⅱ类整合子可变区扩增阳性,大小为2 106bp;整合子可变区含有编码对氨基糖苷类抗生素耐药的基因(aadA1、aadA2、aadA5、aadA22、aadB、aacA4和sat2),编码对磺胺类抗生素耐药的基因(dfrA1、dfrA12、dfrA17),编码对氯霉素抗生素耐药的基因(cmlA1、cmlA6)。因此,整合子在大肠埃希菌中广泛存在,辽宁地区大肠埃希菌中整合子主要携带编码对氨基糖苷类、磺胺类和氯霉素耐药基因盒。     

鸡源大肠杆菌整合子及基因盒分子流行病学研究

对河南省鸡源大肠杆菌Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子及其携带的耐药基因盒进行了分子流行病学研究。结果表明：51株鸡源大肠杆菌中86．3％（44／51）检出Ⅰ类整合子,3．9％（2／51）检出Ⅱ类整合子,未检出Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合子共检出5种类型的基因盒,分剐是sat基因盒（100％）,dfrAl＋aadAl基因盒（45．4％,20／44）,dfrAl7＋aadA5基因盒（22．5％,9／44）,dfrAl＋sat＋aadA2基因盒（6．8％,3／44）和4800bp未知基因盒（27．3％,12／44）,其中4800bp未知基因盒的下游携带有ESBLCTX-M基因,Ⅱ类整合子的基因盒携带dfrAl＋sat＋aadAl3种基因。     

健康鸡源肺炎克雷伯菌检测到质粒介导喹诺酮耐药qnrA基因

通过PCR技术检测195株健康动物肠杆菌中qnrA基因的流行情况;琼脂稀释法对qnrA阳性菌株进行8种抗菌药物的药物敏感性试验;质粒接合转移试验研究qnrA的可转移性;Southern杂交对qnrA基因进行定位;PCR检测qnrA阳性菌中Ⅰ类整合酶intI基因的携带情况.结果表明,195株肠杆菌中检出1株qnrA阳性的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae GDKA1,经Blast鉴定为qnrA1.药物敏感性试验表明GDKA1对磺胺甲恶唑、氨苄西林、大观霉素、氯霉素、四环素耐药,对环丙沙星(MIC=0.019 mg·L-1),头孢噻肟(MIC=0.047 mg·L-1)表现敏感,对萘啶酸(MIC=12 mg·L-1)表现为部分敏感.接合试验表明qnrA1位于可转移的质粒上,且可以通过接合试验水平传播.接合子TGDKA1对喹诺酮类药物的敏感性比大肠埃希菌Escherichia coli J53 AzR稍高,但远低于GDKA1·South-ern杂交进一步证实了qnrA1基因位于质粒上.TGDKA1的质粒扩增出intI1,表明qnrA1阳性菌株携带I类整合子.可见,qnrA1基因已在健康鸡源肺炎克雷伯菌中出现且同时携带I类整合子位于质粒上,整合子灵活多样的存在方式和传播方式为qnrA基因的传播提供了便利条件,整合子可能携带qnrA基因通过食物链传播给人,因此健康动物共生菌携带qnrA1基因值得注意.