猪-鱼复合养殖模式中气单胞菌I类整合子的流行情况及其耐药特征

为了解广东地区猪-鱼复合养殖模式下气单胞菌整合子流行情况及其耐药特征,从广东省5个不同猪-鱼复合养殖场采集分离猪粪、鱼、池塘水及池塘底泥的气单胞菌共317株,通过微量二倍稀释法测定其对20种药物的敏感性;PCR扩增Ⅰ类整合子整合酶基因intI1,并分析其基因盒阵列结构。结果表明,317株气单胞菌对20种药物耐药程度不一,氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶、萘啶酸的耐药率相对较高。intI1的检出率为15.77%,鱼源和猪源的整合子检出率高于环境源。整合子阳性菌对测试的12种药物的耐药率显著高于阴性菌,且表现为多重耐药;50个Ⅰ类整合子共检测到16种耐药基因盒,包括了编码氨基糖苷类耐药基因aadA1、aadA2、aac6-Ⅱ、aacA4,甲氧苄啶耐药基因drfA1、dfrA12、dfrA15、dfrA17、dfrB4,β内酰胺类耐药基因bla_(OXA-10)、bla_(OXA-21),氯霉素耐药基因catB3、catB8,利福平耐药基因arr2、arr3以及质粒介导的喹诺酮类耐药基因aac(6')-Ib-cr。携带了不同类耐药基因盒的整合子阳性菌还表现出所对应的对甲氧苄啶、链霉素、氯霉素类等的耐药表型,由此推测整合子的存在与细菌的多重耐药密切相关。研究表明,I类整合子分布于广东地区猪-鱼复合养殖模式下不同来源气单胞菌,并介导细菌对多种抗菌药物耐药。有必要开展畜禽-鱼复合养殖模式下细菌耐药性的传播机制研究,为水产养殖合理用药提供依据。     

罗非鱼不同养殖阶段喹诺酮类耐药菌群数量与组成分析

[目的]评估不同养殖阶段罗非鱼肠道及养殖环境中喹诺酮类耐药菌产生的风险,筛选出水产养殖耐药性监测指示菌,为建立科学的水产品耐药防控技术提供参考依据.[方法]选取萘啶酸(第一代)和恩诺沙星(第三代)2种喹诺酮类药物,通过平板计数法统计不同养殖阶段(苗种阶段、中间阶段及上市阶段)罗非鱼肠道及养殖环境(池塘水和底泥)中喹诺酮类耐药菌的数量及耐药率,然后采用高通量测序分析不同养殖阶段喹诺酮类耐药菌群的结构特征及组成变化.[结果]在不同养殖阶段罗非鱼肠道及其养殖环境中的细菌总数相对稳定,罗非鱼肠道的细菌总数维持在4.6×105~1.6×106 CFU/g,池塘水的细菌总数维持在5.2×103~2.1×104 CFU/g,池塘底泥的细菌总数维持在4.8×103~3.2×104 CFU/g.苗种阶段罗非鱼肠道菌群对萘啶酸和恩诺沙星的耐药率均高于中间阶段和上市阶段,分别为34.7%和19.0%.各养殖阶段的罗非鱼肠道及养殖环境优势菌群均以气单胞菌属、埃希菌—志贺氏菌属、鲸杆菌属、邻单胞菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属细菌为主.随着养殖阶段的推移,罗非鱼肠道中的气单胞菌属相对丰度呈下降趋势,而鲸杆菌属呈上升趋势;而养殖环境中的菌群结构无明显规律性变化.在罗非鱼肠道及养殖环境喹诺酮类耐药菌群中,埃希菌—志贺氏菌属和气单胞菌属的相对丰度较高,且随着养殖阶段的推移呈不同程度上升趋势.[结论]罗非鱼养殖的耐药风险主要集中在养殖前期阶段,埃希菌属和气单胞菌属是喹诺酮类耐药的主要菌群,应加强不同养殖阶段的饲养管理,减少病害发生以减轻抗菌药物使用带来的风险.此外,可选用埃希菌属和气单胞菌属作为水产养殖细菌耐药性监测的指示菌,实时监控喹诺酮类药物耐药性的产生与传播.     

广东西枝江-东江流域抗生素抗性基因污染特征研

抗生素抗性基因（Antibiotics Resistance Genes, ARGs）污染已成为全球性环境问题之一。于枯水季对广东西枝江-东江流域的淡水河、西枝江、东江干流上120多公里河段范围采样,共10个点,每个点同步采集水样和沉积物样品,采用实时荧光定量PCR方法,测定了3种代表性磺胺类耐药基因（sul1、sul2、sul3）及2种代表性整合酶基因（int1、int2）的存在及其丰度。结果显示,水样及沉积物样品中sul1、sul2、sul3和int1、int2均具有100%检出率,表明西枝江-东江流域水环境受到这5种抗生素抗性基因的污染。sul1和sul2在水样和沉积物中的绝对丰度和相对丰度最高,为优势抗性基因。抗性基因丰度在水体和沉积物间,具有较好的相关性（R2=0.64）。无论水体和沉积物,一些抗性基因之间也存在显著的正相关：sul1和int1（R2>0.95,P=0.000<0.01）,sul1和sul2（R2> 0.8, P=0.002<0.01）,sul2和int1（R2>0.8,P=0.004<0.01）。西枝江-东江流域的不同采样点的丰度水平并没有明显峰值,从支流到干流抗性基因丰度未随着水量的增加而削减,反而随着微生物繁殖和新的污染源排放而不断富集。     

多子小瓜虫感染后草鱼TLR信号通路基因 的表达动态

【目的】明确草鱼Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路基因在防御多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)感染过程中的免疫作用,为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。【方法】以多子小瓜虫感染草鱼后,采用实时荧光定量PCR检测分析在不同时间点(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草鱼部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化。【结果】草鱼感染多子小瓜虫后,TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮肤和脾脏中的表达主要呈上调趋势,TLR4基因在皮肤中主要呈上调表达,在脾脏中则主要呈下调表达;TLR信号通路接头蛋白基因MyD88和TRIF的表达变化趋势明显不同,其中,MyD88基因的表达在感染后第1～3 d均呈显著上调趋势(P0.05,下同),而TRIF基因的表达在整个试验过程中绝大多数时间点与对照组无显著差异(P0.05);IRAK4和IRAK1在皮肤和脾脏中的表达也主要呈上调趋势,但在脾脏中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表达呈显著下调趋势;IL-1β和TNF-α在绝大多数时间点均显著上调,但IFN的表达基本没有变化。【结论】草鱼TLR信号通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及下游细胞因子(IL-1β和TNF-α)均参与防御多子小瓜虫感染的免疫反应,尤其是在感染早期和中期发挥关键作用。     

广东西枝江-东江流域抗生素抗性基因污染特征研究

抗生素抗性基因（Antibiotics Resistance Genes,ARGs）污染已成为全球性环境问题之一。于枯水季对广东西枝江一东江流域的淡水河、西枝江、东江干流上120多公里河段范围采样,共10个点,每个点同步采集水样和沉积物样品,采用实时荧光定量PCR方法,测定了3种代表性磺胺类耐药基因（sul1、sul2、sul3）及2种代表性整合酶基因（int1、int2）的存在及其丰度。结果显示,水样及沉积物样品中sul1、su12、sul3和int1、int2均具有100％检出率,表明西枝江一东江流域水环境受到这5种抗生素抗性基因的污染。sull和sul2在水样和沉积物中的绝对丰度和相对丰度最高,为优势抗性基因。抗性基因丰度在水体和沉积物间,具有较好的相关性（R2—0．54）。无论水体和沉积物,一些抗性基因之间也存在显著的正相关：sul1和int1（R2〉0．95,P=0．000〈0．01）,sul1和sul2（R^2〉0．8,P=0．002〈0．01）,sul2和int1（R^2〉0．8,P=-0．004〈0．01）。西枝江一东江流域的不同采样点的丰度水平并没有明显峰值,从支流到干流抗性基因丰度未随着水量的增加而削减,反而随着微生物繁殖和新的污染源排放而不断富集。     

罗非鱼水产品中的喹诺酮类药物耐药菌和耐药基因检测分析

本研究旨在了解水产品中携带的细菌对喹诺酮类药物的耐药状况及耐药基因类型,评估水产品中细菌耐药性风险。从广州市14家超市随机购买100条鲜活的罗非鱼,高通量测序分析结果显示,罗非鱼携带的优势菌群为大肠埃希菌(Escherichia hydrophila)和气单胞菌(Aeromonas)。采用大肠埃希菌和气单胞菌筛选培养方法,分别从鳃、肌肉和肠内容物筛选分离出182株大肠埃希菌和280株气单胞菌;运用琼脂二倍稀释法测定了恩诺沙星和环丙沙星对分离菌株的最小抑菌浓度;通过PCR法扩增质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)基因(qnrA、qnr B、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6￠)-Ib-cr、qepA、oqxAB)并进行测序和比对分析。结果显示,分离的气单胞菌对恩诺沙星和环丙沙星的耐药率分别为2.50%和2.14%;分离的大肠埃希菌对恩诺沙星和环丙沙星的耐药率分别为25.82%和18.13%。肌肉中分离的气单胞菌和大肠埃希菌对恩诺沙星和/或环丙沙星的耐药率均低于鳃和肠道的;各组织分离的大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药率均远高于气单胞菌。分离菌株中,携带PMQR基因的大肠埃希菌占59.89%,且检出的耐药基因种类较多,包括qnrB、qnrD、qnrS、aac(6?)-Ib-cr和oqx AB;而携带PMQR基因的气单胞菌仅占6.79%,只检出耐药基因aac(6￠)-Ib-cr和qnrS。结论认为,罗非鱼食用部分肌肉携带的耐药菌较少,食品相对安全;肠道和鳃组织携带的耐药菌以大肠埃希菌为主,而且大部分菌株携带有不同类型的PMQR基因,存在一定的耐药传播隐患。     

水产动物源气单胞菌喹诺酮类耐药与PMQR基因、QRDR突变相关性分析

为了解PMQR基因、QRDR突变与气单胞菌喹诺酮类耐药相关性,以116株水产源气单胞菌为研究对象,采用PCR法检测PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr)并分析QRDR靶基因gyrA、parC突变情况,用微量二倍稀释法测定萘啶酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)的最小抑菌浓度(MIC)值。结果表明:116株气单胞菌中,有18株(15.52%)菌株携带PMQR基因,其中8株(6.90%)携带qnrS2基因,9株(7.76%)携带aac(6′)-Ib-cr基因,1株同时携带qnrS2、aac(6′)-Ib-cr基因,未检测到qnrA,qnrB和qepA基因;56株(48.28%)菌株发生QRDR靶位点突变,主要突变方式为GyrA:Ser~(83)Ile和GyrA:Ser~(83)Ile+ParC:Ser~(87)Ile;对NAL、CIP及ENR耐药率分别为47.41%、12.07%及11.21%;7株仅携带qnrS2基因菌株未发生QRDR突变,对喹诺酮类药物敏感性略下降,NAL、CIP及ENR的MIC值分别小于4.00、0.50和1.00mg/L;10株携带aac(6′)-Ib-cr基因的菌株均发生QRDR突变并对NAL表现耐药,MIC值均128.00mg/L,其中8株对CIP和ENR表现耐药,MIC值均≥4.00mg/L;发生gyrA单突变或gyrA和parC双突变菌株均对NAL表现耐药,MIC值均≥64.00mg/L,CIP和ENR的MIC值有的4.00mg/L,有的≥4.00mg/L。综上,QRDR靶基因突变可影响水产动物源气单胞菌对萘啶酸的药物敏感性,而气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药可能与PMQR和QRDR协同作用有关。     

广东主要水产养殖地区气单胞菌耐药状况 的调查分析

【目的】了解广东主要水产养殖地区气单胞菌的耐药状况,为评估水产养殖中的细菌耐药性风险提供科学依据。【方法】2014—2016年每年7—9月分别对广东佛山、肇庆、韶关和阳江等4市6区(县)16个养殖户共20个池塘(均为无发病史池塘)进行动物样品及环境样品采集,分离纯化气单胞菌,然后采用微量二倍稀释法测定分离菌株对14种抗菌药物的敏感性。【结果】从采集的590份样品中分离纯化获得1143株气单胞菌,鉴定为8个种,分别为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,占60.28%)、简达气单胞菌(A. jandaei,占18.11%)、温和气单胞菌(A. sobria,占7.96%)、嗜水气单胞菌(A. hydrophila,占7.09%)、豚鼠气单胞菌(A. caviae,占5.86%)、达卡气单胞菌(A. dhakensis,占0.35%)、A.simiae(占0.26%)和舒伯特气单胞菌(A. schubertii,占0.09%)。1143株分离菌株对14种抗菌药物的敏感性表现不一,其中,对氨苄西林的耐药率最高(97.81%),对磺胺间甲氧嘧啶和萘啶酸中度耐药(69.55%和46.72%),对其他11种抗菌药物相对敏感,耐药率均在20.00%以下。豚鼠气单胞菌的多重耐药率最高(25.37%),其次是嗜水气单胞菌(11.11%),温和气单胞菌、简达气单胞菌和维氏气单胞菌对各类抗菌药物相对敏感,多重耐药率分别为2.20%、1.93%和1.74%。畜禽粪便分离菌株的多重耐药率较高(10.53%),其次是鱼组织分离菌株(5.88%),而池塘水和底泥分离菌株相对敏感,多重耐药率分别为3.35%和1.95%。畜禽—鱼复合养殖模式和非复合养殖模式气单胞菌分离菌株均对新霉素完全敏感,但前者对其他13种药物的耐药率均高于后者;高密度养殖杂交鳢及复合养殖模式下团头鲂和麦鲮源分离菌株的耐药率较高,而一些经济价值相对较低的品种如罗非鱼和草鱼,其分离菌株多重耐药率较低。【结论】广东主要水产养殖地区气单胞菌耐药率总体水平不高,耐药程度与养殖水平、用药习惯及养殖模式等有关,磺胺类耐药性已成为水产养殖细菌病害防治过程中最突出的问题,因此,非常有必要开展水产养殖病原菌耐药性监测,了解其发展趋势及传播风险,为评估水产品质量安全及指导临床科学用药提供科学依据。     

单次投喂乳酸诺氟沙星在鳜鱼体内的代谢消除规律

水温(28±2)℃时,按20mg/kg的剂量给平均体质量(500±10)g的鳜鱼单次口服乳酸诺氟沙星,服药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96h,分别测定鳜鱼血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的药物含量,采用非房室模型分析药物在鳜鱼体内的代谢消除规律。结果显示,乳酸诺氟沙星在鳜鱼血浆、肌肉、肝脏、肾脏中的达峰时间分别为4.333、6、3、5h,达峰质量浓度分别为3.625、2.39、33.089、19.375mg/L,各组织中肝脏吸收的药物含量最高,其次是肾脏、血浆和肌肉;乳酸诺氟沙星在鳜鱼血浆、肌肉、肝脏、肾脏中的消除半衰期分别为42.589、131.652、16.830、30.558h,药物在肝脏中消除速度最快,而在肌肉中消除最慢。以肌肉中药物残留限量为50μg/kg计,建议单次投喂乳酸诺氟沙星的休药期不低于24d。