规模化畜禽养殖场粪便中多重耐药菌分离鉴定及其耐药特征

为了解禽畜粪便中多重耐药菌的污染特征,本研究对鸡粪、牛粪、猪粪和有机肥这4种不同样品中多重耐药菌进行了计数分析,并对不同来源的多重耐药菌株进行了分离和纯化,进一步开展了基于16S rDNA序列比对的分子生物学鉴定以确定其种属地位,以及基于药敏试验的耐药性特征分析。结果表明:不同养殖动物粪便中四环素、恩诺沙星、磺胺甲恶唑和泰乐菌素4种抗生素多重耐药菌的绝对数量和相对数量排序均为鸡粪>猪粪>牛粪,粪源有机肥中可培养的多重耐药菌的绝对数量和相对数量在堆肥后均有所下降。通过对耐药菌株鉴定和分类学分析,发现禽畜粪便中多耐药菌的菌门集中分布在Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria,多重耐药菌的优势菌属为Escherichia、Corynebacterium、Kurthia;而有机肥样品中多重耐药菌的优势菌属为Staphylococcus、Glutamicibacter。菌株的药敏试验表明,3类动物粪污中的多重耐药菌都对红霉素、四环素有着较高的耐药率,均高于80%,而对阿米卡星这种抗生素表现出较好的敏感性,其耐药率低于30%。通过对Ⅰ、Ⅱ类整合子基因盒的扩增,发现PCR产物的大小从0.8 kb到1.8 kb不等,基因盒ad A2、dfr A17、dfr A1及sat2在养殖场粪污中检出率均较高。     

高温持续时间对鸡粪堆肥中多重耐药菌、接合型质粒及耐药基因消减特征的影响

为研究堆肥过程中高温持续时间对多重耐药大肠杆菌及其携带的接合型质粒和抗生素耐药基因（Antibiotic resistancegene,ARGs）消减规律的影响,本研究在鸡粪堆肥初始物料中外源添加多重耐药大肠杆菌菌液,并设置延长高温时间组（CT组）和常规堆肥组（NT组）两种堆肥条件处理,利用选择性培养及16S rRNA基因扩增子测序技术检测多重耐药菌群变化规律,同时利用数字PCR定量检测大肠杆菌16S rRNA基因、接合型质粒转移酶基因（MOBP）、氨基糖苷类耐药基因[APH（3）-Ib]及磺胺类耐药基因（sul2）和Ⅰ类整合子-整合酶基因（intl1）等污染物相对丰度变化,对比获得了延长高温时间对多重耐药菌及其ARGs消减速率的影响。结果表明,高温堆肥能够明显抑制堆肥中多重耐药菌的生长,并且CT组对其的抑制效果明显好于NT组。堆肥结束后,五种基因在CT组的相对丰度消减率为79.82%~99.99%,但NT组中腐熟期结束后APH（3）-Ib、sul2、intl1等基因相对丰度均高于初始物料。多重耐药大肠杆菌及其接合型质粒的消减规律均符合一级动力学方程,但APH（3）-Ib、sul2和intl1等基因在NT组的消减动力学却呈现明显的两段化特征,延长高温时间（CT组）能够抑制腐熟期出现的反弹。细菌群落结构分析表明,NT组中ARGs丰度再次增加与Moheibacter、Halomonas等菌属的富集相关。本研究表明,在堆肥过程中,延长高温持续时间,可降低堆体中部分ARGs潜在宿主菌的丰度,阻断其垂直传播的作用,最终减少成品肥中ARGs的丰度。     

堆肥过程逸散抗生素耐药菌气溶胶的浓度及粒径分布特征

利用FA-I撞击式采样器采集5家堆肥厂内外生物气溶胶样本,对具有抗生素耐药性的细菌气溶胶浓度和粒径分布进行检测,并对其随传播距离的变化规律加以分析。结果表明:堆肥生产区细菌气溶胶浓度高达2.65×10~4CFU·m~(-3)。具有四环素和红霉素耐药性的气溶胶分别达到9.54×10~3CFU·m~(-3)和7.39×10~3CFU·m~(-3),占总细菌的36.44%和40.20%。以上3种生物气溶胶在细颗粒物中的相对丰度为13.04%～37.23%,且该丰度随逸散距离的增加而呈现下降趋势。红霉素和四环素耐药菌动力学粒径研究结果显示,两种耐药菌可能主要沉降在人体的咽喉部。     

促生长抗生素禁用后养猪场多重耐药菌群及耐药特征变化

由于频繁使用抗生素，养殖动物粪便中多重耐药菌会给周边环境带来生态风险。为了解促生长类抗生素（Antibioticgrowth promoters，AGPs）禁用后养猪场来源多重耐药菌群的变化特征，本研究采集AGPs禁用前后猪场粪便样品，开展了多重耐药菌计数、分离培养及鉴定，并利用16S rRNA基因扩增子测序对可培养多重耐药菌群进行比对分析，同时利用药敏试验分析了AGPs禁用前后多重耐药菌株的耐药变化特征。结果表明：禁用AGPs后猪场粪便中多重耐药率显著下降。AGPs（主要为土霉素）残留浓度能够显著影响禁用前后的多重耐药菌群分布，同时AGPs禁用也能够显著减少猪粪中的多重耐药菌种类。猪粪中多重耐药菌主要分布在变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，Escherichia在所有样本中均是优势多重耐药菌属，Kurthia、Providencia、Leucobacter、Corynebacterium、Ignatzschineria、Lysinibacillus、Staphylococcus等多重耐药菌属相对丰度在禁用AGPs后有所减少。禁用AGPs能够降低猪粪中多重耐药菌的饲用抗生素的耐药率，如四环素类、氯霉素类、大环内酯类等，但也会升高治疗用抗生素如氨基糖苷类、头孢类、利福平类抗生素的耐药率。