番茄果实中LeERFl、LeERF2基因的克隆及序列分析

乙烯反应元件结合蛋白属于植物特有的一个转录因子家族,这个家族保守的DNA结合域称为ERF结构域.根据对番茄(Lycopersicon esculenturm)和其它植物物种中EREBP基因家族的同源性比较,在保守区(ERF区域)设计合成一对简并引物,通过RT-PCR扩增得到一个114bp的片段,用此片段作探针筛选番茄cDNA文库(粉红期),得到两个基因LeERFl和LeERF2.通过BLAST工具在GenBank中搜索表明,LeERFl和LeERF2基因属于EREBP家族,LeERFl与EREBP-4和DDTFRl0/A在氨基酸水平上的序列相似性为35%,LeERF2与EREBP-3和pti5在氨基酸水平上的序列相似性为46%,是新的基因.LeERFl和LeERF2的核酸序列在GenBank发表,登录号分别为AY077626和AY275554.     

番茄果实中成熟衰老相关small RNAs的最新研究进展

番茄(Lycopersicon esculentum)是研究果实成熟衰老的模式材料,其成熟是一个多基因调控的高度协调的遗传调控过程,伴随着色泽、质地、风味、香气和其他代谢等许多显著的生理生化变化.近年来,small RNAs作为一种新型的转录后调控因子受到越来越多的关注,几乎参与了动植物中所有的生理和生化过程.在植物中参与生长发育、果实成熟、生物和非生物胁迫反应等过程.本文系统地综述了番茄果实中small RNAs的分离鉴定现状,对番茄果实中与乙烯信号途径、颜色、风味、软化等代谢途径相关的small RNAs进行了系统总结,并展望了未来small RNAs在果实成熟过程中的相关研究方向.     

脂氧合酶与番茄采后成熟的关系

采后番茄果实组织的脂氧合酶（ＬＯＸ）活性随成熟衰老期的进程而改变，从绿熟期（ＭＧ）到转红期（Ｔ）ＬＯＸ酶的活性逐渐增高，然后降低，其模式呈现跃变型果实的特点。利用外源乙烯分别处理绿熟期、发白期和转红期的果实，其ＬＯＸ酶的活性较对照都有明显提高。用ＬＯＸ酶处理番茄果实组织，乙烯产量没有明显提高，然而电导率有大幅度增加，二羟基萘（ＤＨＮ）能部分抑制ＬＯＸ酶的这一作用。ＬＯＸ酶的活性增加需要有果蔬体内乙     

反义LeEIL2基因表达载体的构建及在番茄中的转化

为了研究LeEIL2基因在番茄果实成熟过程中的作用 ,将全长的番茄LeEIL2基因以反义方向构建到植物表达载体 pBI1 2 1上 ,经过酶切鉴定正确后 ,将该载体转入农杆菌EHA1 0 5中 ,通过农杆菌介导法转化番茄 ,经组织培养和抗性筛选获得再生植株 ,PCR检测再生植株 ,初步鉴定为阳性植株 ,为获得转反义LeEIL2番茄果实打下基础。     

番茄后熟期细胞超微结构与乙烯合成酶(EFE)活性关系的研究

对番茄采后各后熟生理时期的 ACC,乙烯水平及 EFE 酶活性变化以及与之相应的细胞超微结构进行了观察。乙烯产量从绿熟期到转红期没有明显变化,且水平相对较低。同时这几个时期的 ACC 水平也较一致。进入粉红期乙烯产量迅速上升并达到高峰,这时 ACC 水平降至最低点。高峰过后的全红期,过熟期乙烯水平迅速下降,而这时 ACC 水平逐渐上升至最高水平。EFE 酶活性在乙烯高峰前逐渐上升到最大值,高峰过后活性骤然降低直至失去活性。通过电镜观察,采后番茄果实细胞结构的最大变化在于乙烯高峰过后细胞壁的解体和质壁分离。在整个后热过程中,细胞膜结构、各细胞器依然完好,由于 ACC 的大量积累和乙烯水平下降与 EFE 活性有关,从而推断 EFE 酶的活性及作用不仅与膜结构有关而且同与膜有密切联系的细胞壁有关。     

低温、乙烯逆境下的番茄NR基因表达及相关反应

通过低温和乙烯逆境下番茄植株的生长表现和抗性生理指标的变化及乙烯受体蛋白基因NR的表达，研究了NR基因与低温和乙烯的关系。结果显示：低温(5℃)抑制了NR基因的表达，维持了细胞膜的完整性，并减轻和延缓番茄实生苗因乙烯胁迫所产生的黄化、衰老等症状；外源乙烯增加植株细胞膜透性，处理的时间越长、细胞膜透性增加得越多，但低温可以推迟这一进程；低温和乙烯都可显著增加植株叶片蒸腾作用、呼吸作用和气孔导度；在有和无外源乙烯时，低温和乙烯抑制剂Ag^ 均抑制番茄NR基因的表达。因此认为低温抑制了NR基因的表达，降低了植物对乙烯的敏感性，减轻和延缓了因胁迫乙烯的产生而造成的伤害；而抑制NR基因的表达，能提高植物的抗逆性；NR基因是乙烯和低温胁迫症状的正调节因子。     

番茄Metacaspase基因(LeM)的克隆及其在大肠杆菌Rosetta中的高效表达

为获得可溶性的番茄Metacaspase蛋白,后续研究Metacaspase蛋白的酶学特性以及功能,利用RT-PCR方法克隆了番茄(Lycopersicon esculentum)中Metacaspase(LeM)全长cDNA,并成功地构建了LeM基因的原核表达载体重组质粒pET28a-LeM,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PlysS和Rosetta中进行诱导表达,并对诱导表达条件进行了优化.SDS-PAGE结果显示,在37℃条件下,1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,在BL21(DE3)PlysS菌株中重组蛋白主要以包涵体形式存在,而相同条件下在Rosetta菌株中多为可溶性表达.同时酶活测定显示,Rosetta上清中LeM的活性为33 RFU/min,显著高于BL21(DE3)PlysS 7RFU/min.本实验表明,不同菌株对Metacaspase的可溶性表达有很大影响.     

玉米In5-2启动子功能区域在洋葱瞬时表达系统中的分析

本研究旨在通过对根癌农杆菌侵染洋葱表皮细胞的条件进行优化,从而建立一种新的瞬时表达系统,并将其应用于玉米In5-2启动子的功能区域的分析中,明确In5-2启动子的乙酰苯胺类化合物诱导元件的具体位置.在本研究中采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染洋葱(Allium cepa)表皮细胞,对转β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的瞬时表达进行研究,并分析了侵染液中乙酰丁香酮(As)的浓度、侵染时间、菌液浓度、共培养时间对GUS基因的瞬间表达的影响.结果显示,在OD600值为0.8的农杆菌液中感染15 min,共培养3 d,能够得到较高的GUS基因瞬间表达,从而建立了一种新的瞬间表达系统.同时,构建了含不同长度的玉米(Zea mays)In5-2启动子片段缺失载体,利用新的瞬时表达系统分析其功能区域,推测出乙酰苯胺类化合物诱导元件位于ATG上游-220～-143 bp之间.结果表明新的瞬时表达系统可以快速有效地进行启动子的分析.     

专家发言要点摘编

农产品安全或者食品安全主要是指一些污染物质对农产品的污染造成的一些安全隐患和不安全因素。我国的食品安全工作经过近二十年的发展,取得了一定的成绩。总体上来说逐步建立了一套完整的管理体系,加强了法律法规建设,建立了一套健全的管理体制,强化了管理和技术支撑体系。     

李果实高质量RNA提取方法的比较和优化

李果实富含酚类和多糖,成熟李果实的总酚和总糖含量分别可达140.28μg/g和80.75mg/g,因此常规方法不能有效提取其RNA以进行分子生物学研究。比较了改良的异硫氰酸胍法、改良的Trizol法、改良的CTAB法和高氯酸盐法提取李果实RNA的效果,结果表明高氯酸盐法效果较好。根据李果实材料的特点,进一步优化了高氯酸盐法,包括用0.1mol/LTris-硼酸缓冲液(pH7.4)取代0.3mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.3);提取缓冲液中β-巯基乙醇的浓度由1%提高到2%,可溶性PVP的浓度由8.5%降低至1%;联合使用10%乙醇和醋酸钾以除去多糖;用12000×g离心替代使用填充有玻璃丝的Centriflo柱实现分离提取缓冲液中杂质的目的等。在230、260和280nm下测定所提取RNA的吸光值,并用提取的RNA反转录后扩增β-actin基因片段验证RNA的质量,结果表明:用优化了的高氯酸盐法提取李果实的RNA完整性好,杂质少,得率较高,适用于RT-PCR等后续实验,并且也适合提取其他富含酚类物质或多糖果实的RNA。