番茄果实高质量总RNA的提取富集及RT-PCR检测

以番茄果实为材料,比较了3种在果实中提取RNA的方法,针对番茄果实多糖的特点,利用无水乙醇和异丙醇联合沉淀的方法除去多糖,改良了Trizol法.为了检验含量比较低的miRNA,利用Licl沉淀的方法进行富集.结果表明:改良Trizol法能够有效地去除多糖,提取到的RNA 28S rRNA亮度约为18S rRNA的2倍,A260与A280比值为1.84,A260与A230比值为1.92,RNA产率为350.4 μg/g,说明利用改良Trizol法从番茄果实中提取的RNA质量好、完整性好.由此法所得的RNA可直接用于cDNA文库构建等分子生物学实验.     

转基因产品中抗除草剂基因的PCR检测

抗除草剂作物占全球转基因作物的75％以上，并且这类作物还有不断增加的趋势。首次建立并优化了对4类转基因作物（大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、棉花（Gossypium hirsutnm）和油菜（Brassica campestris var.oleifera））的5种外源抗除草剂基因（bar、pat、cp4-epspsI、cp4-epsps2和gox）的PCR检测方法，并在实践中应用。结果表明，本方法灵敏特异、结果准确可靠，可对目前批准的所有抗除草剂转基因产品进行定性检测。     

番茄果实中LeERFl、LeERF2基因的克隆及序列分析

乙烯反应元件结合蛋白属于植物特有的一个转录因子家族,这个家族保守的DNA结合域称为ERF结构域.根据对番茄(Lycopersicon esculenturm)和其它植物物种中EREBP基因家族的同源性比较,在保守区(ERF区域)设计合成一对简并引物,通过RT-PCR扩增得到一个114bp的片段,用此片段作探针筛选番茄cDNA文库(粉红期),得到两个基因LeERFl和LeERF2.通过BLAST工具在GenBank中搜索表明,LeERFl和LeERF2基因属于EREBP家族,LeERFl与EREBP-4和DDTFRl0/A在氨基酸水平上的序列相似性为35%,LeERF2与EREBP-3和pti5在氨基酸水平上的序列相似性为46%,是新的基因.LeERFl和LeERF2的核酸序列在GenBank发表,登录号分别为AY077626和AY275554.     

食物源SARS病毒基因的快速检测

本研究针对通过食物链传播的严重急性呼吸综合症(SARS)病毒检测技术展开研究,建立从RNA提取SARS病毒基因的RT-nested PCR检测、质量控制在内的SARS病毒检测技术体系.     

转基因产品中PAT蛋白的酶联免疫检测

建立并优化了转基因油菜(Brassica campestris )中的PAT蛋白酶联免疫检测技术。首先通过Western杂交和酶活性分析鉴定了PAT蛋白的纯度和活性。然后以其为抗原免疫新西兰大白兔制备了PAT蛋白的多克隆抗体，并采用硫铵沉淀法和protein A-Sepharose 4B对其进行了纯化。所得抗体对PAT蛋白的检测限为2×10-5 mg/mL，且与植物源的几种结构功能相关蛋白均无交叉反应。然后对植物蛋白进行初步提取，应用酶联免疫检测技术对转基因油菜(MS1/RF1 and MS8/RF3)中的PAT蛋白进行了检测，结果表明ELISA能高效地鉴别转基因和非转基因油菜.     

bar因在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的分离和纯化

bar基因来源于P3301质粒载体,通过构建PB813测序载体对bar基因进行了测序,与GenBank中bar基因全编码区比较发现：在DNA上有两个碱基不同,但在蛋白质水平上完全相同。用PCR方法从P3301载体上克隆了552碱基的bar基因全长序列插入到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET30a( )中,构建了pET30a-bar融合表达载体并转人大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-bar融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了膦丝菌素乙酰转移酶(PAT),并通过金属鏊和层析一步纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了PAT纯品。     

乙烯受体基因LeFTR1和LeFTR4的克隆及在番茄果实中的表达

为研究野生型番茄(Lycopersicon esculentum Mill．cv．Lichun)和转反义ACS番茄果实中乙烯受体基因上eETR1和LeETR4的表达与乙烯的关系，实验用RT-PCR方法扩增了乙烯受体基因LeETR1和LeETR4片段，用两片段作探针进行Northern杂交。结果表明：两受体基因的表达在番茄果实成熟进程中变化不明显，LeETR4在同一时期的果实外果皮中表达水平低于其在辐射壁和中柱的表达。转反义ACS番茄果实中LeETR1和LeETR4的表达水平显著低于野生型番茄果实，外源乙烯处理转反义ACS番茄果实，促进两个受体基因的表达。可见果实中LeETR1和LeETR4的表达受乙烯调控的影响。     

反义NR转基因株的分子检测和生理特性的研究

为了研究NR基因的作用,通过番茄反义NR转基因株的southem,northem杂交,从入地成活的139个卡那霉素筛选出的转化株中,鉴定出了2株突变体,并对其相关的生长发育、生理指标进行了测定。研究结果显示：NR基因的表达被抑制后,突变体细胞膜透性、蒸腾作用和气孔导度比野生型植株的高,但呼吸作用低于野生型;果实成熬推迟。各突变体植株的分枝数减少,节间明显伸长,茎增粗;特别是NR2突变体节间最长、且生长健壮、茎粗、叶大、开花多,但不易结实、花粉粒数量减少、花粉萌发率仅2％—3％。总之,乙烯受体蛋白NR基因被抑制后,突变体植株表现出促进生长,推迟发育和成熟,即乙烯的作用被抑制的现象。说明NR基因是乙烯生物合成和信号转导的正调节因子。     

低温、乙烯逆境下的番茄NR基因表达及相关反应

通过低温和乙烯逆境下番茄植株的生长表现和抗性生理指标的变化及乙烯受体蛋白基因NR的表达，研究了NR基因与低温和乙烯的关系。结果显示：低温(5℃)抑制了NR基因的表达，维持了细胞膜的完整性，并减轻和延缓番茄实生苗因乙烯胁迫所产生的黄化、衰老等症状；外源乙烯增加植株细胞膜透性，处理的时间越长、细胞膜透性增加得越多，但低温可以推迟这一进程；低温和乙烯都可显著增加植株叶片蒸腾作用、呼吸作用和气孔导度；在有和无外源乙烯时，低温和乙烯抑制剂Ag^ 均抑制番茄NR基因的表达。因此认为低温抑制了NR基因的表达，降低了植物对乙烯的敏感性，减轻和延缓了因胁迫乙烯的产生而造成的伤害；而抑制NR基因的表达，能提高植物的抗逆性；NR基因是乙烯和低温胁迫症状的正调节因子。