大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因的多样性分析

根据已经发表的大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位(FedA／ab)的基因序列(fedA／ab)设计1对引物，利用PCR技术从本实验室保存的10株大肠杆菌(F107／86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到一段序列．并克隆至pGEM-T载体，获得重组质粒TF107A、TYCED1A、TYCED2A、TCA、TDA、TEA、T12FA、T8813A、T8199A、T2134PA。通过序列测定，并与已发表的fedA／ab进行比较、基因树分析，可将这10个菌株分为2个基因群，其中F107／86、YCED1、YCED2、C、D、12F与fedA／ab具有高度同源性，属于fedA／ab．大小为513bp；E、8813、8199、2134P构成另一单独的分支，属于fedA／ac．大小为516bp。     

防治奶牛乳房炎基因药物介绍

奶牛乳房炎是世界范围内发生最普遍、防治最难、花费最大的奶牛疾病之一，对奶牛业的危害主要包括以下几个方面：①感染和发病率高，据报道，国外隐性奶牛乳房炎的发生率在20％～60％之间，我国的发生率在46.4％～85.7％之间；②降低奶产量和奶品质。隐性乳房炎能使奶产量降低10％～15％（平均降低3.7千克），因病牛乳汁中含有大量的病原微生物及其毒素，食用后可引起发烧、呕吐、腹泻、脱水、过敏等病理反应；③增加医药费用。据报道，美国治疗一例乳房炎的费用为117～182美元，丹麦为225美元，加拿大为140～300美元，我国平均为23元（无明确评定指标）；④导致牛奶废弃，造成更大损失。因为治疗后的牛奶中有大量的抗菌素残留，应予以废弃，据估计国内弃奶损失高达260元／头。     

重组大肠杆菌的高密度发酵放大工艺研究

在初步筛选获得性价比较好的大肠杆菌高密度发酵培养基的基础上,以表达溶菌酶基因的pcDNKLYZ重组质粒转化的大肠杆菌DH5α为模型,用150 L发酵罐进行工艺放大研究,通过对细菌生长密度(D600 nm值)、质粒产量的比较和分析,探讨用于重组质粒规模化生产的发酵工艺。结果表明:国产培养基中添加100 mL.L-1甘油、磷酸盐和硫酸盐后,重组菌的生长密度和质粒产量均与进口LB培养基接近或略高;收集的菌体分别于-70和-20℃保存,质粒提取和定量检测结果显示保存6周后质粒产量无明显变化;质粒提取和定量检测结果显示每克湿菌用5 mL溶液悬浮,可获得较高的质粒产量。     

细菌表面表达载体的构建与鉴定

用聚合酶链式反应(PCR)技术，从金黄色葡萄球菌中扩增出769bp的编码SPA细胞壁跨膜区的编码序列。将扩增的片断克隆进pEZZ-18载体BamHI和sall位点之间。重组质粒转化大肠杆菌HB101后，根据酶切分析筛选到含有目的基因的重组质粒pZSPAX。序列测定结果表明，该重组质粒中的插入序列与已发表的SPA-X是一致的。通过水肿病毒素B亚单位(SLT-IIeB)基因(slt-IIeB)证实质粒pZSPAX能作为在细菌表面表达目的基因的载体。     

利用SMART技术构建鸡法氏囊全长cDNA表达文库

为构建鸡法氏囊组织互补DNA(cDNA)文库,从3周龄鸡法氏囊组织提取总RNA,用偶联oligo(dT)磁珠纯化mRNA,用SMART(Switching methanism at 5'end of RNA transcrip)技术合成cDNA第1链,用LD-PCR方法扩增双链cDNA.经Sfi Ⅰ酶切消化后,用CHROMA SPIN-400柱去除400 bp以下小片段,获得的双链cDNA与同样酶切的pMyr表达载体连接,电转化大肠杆菌获得cDNA文库.初始文库容量为2.8×106cfu,重组子比例为100%,插入片段的大小平均为1.2 kb.扩增后文库容量为8×1011cfu·mL-1.所建文库为鸡传染性法氏囊病毒受体基因克隆及功能研究奠定基础.     

非洲猪瘟病毒p72基因的纳米金探针研究

对22株发表的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72基因序列进行比较,找出其中的高保守性区域,各设计、合成1条与保守区域互补的5′生物索标记及3′烷巯基修饰短链寡核苷酸探针,并将烷巯基修饰的探针吸附到纳米金颗粒上,制备纳米金标记探针.PCR扩增出的p72基因中的651 bp保守核酸序列,变性后与上述生物素探针及标记纳米金探针进...     

牛白血病病毒GP51蛋白在大肠杆菌中表达及胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立

为了建立一种快速诊断牛白血病(BLV)的检测方法,本研究从BLV中扩增出其囊膜糖蛋白gp51基因,经测序后克隆于表达载体pET32a(+)中,构建了重组表达质粒pET32a-gp51。将其转化受体菌BL21,用IPTG诱导后表达出约42ku的目的蛋白,经western blot检测表明目的蛋白具良好的反应原性。以胶体金标记的羊抗牛IgG(Fc)抗体作为标记抗体,将纯化的His-gp51重组蛋白和羊抗牛IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,各部件按序装配形成快速诊断试纸条。对22份样本分别用试纸条和ELISA试验进行检测,2种方法的阳性符合率为88.9%(8/9),表明本研究建立的胶体金免疫层析方法简便、快捷,具有较好的特异性和一定的敏感性,适宜基层初筛诊断和现场应用。     

大肠杆菌F18菌毛FedE蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的F18菌毛E亚单位的基因序列(fedE)设计1对引物,利用PCR技术从重组质粒TFl07E中扩增到一段序列,并按预定的阅读框架插入到表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedE,并转化大肠杆菌BL21获得重组菌PPFedE。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明：该序列大小为459bp,与GENEBANK中的FedE结构编码序列(Z26520)完全一致。通过对菌体裂解物的SDS—PAGE电泳分析以及Western blotting鉴定,证明重组大肠杆菌PPFedE的可以表达融合蛋白形式的FedE(命名为GST-FedE),即FedE蛋白(16．297ku)与谷胱苷肽转移酶(27．335ku)相连组成分子量为43．632ku的融合蛋白。     

Tet-on系统诱导猿猴病毒40T在CHO细胞中的表达

四环素诱导表达系统（Tet-off／Tet-on系统）是比较成熟的真核生物基因诱导表达系统之一,具有高效、无毒、严密开／关功能的特点。猿猴病毒40T（SV40T）是一种病毒癌蛋白,其与肿瘤抑制蛋白p53和Rb结合,并使之失活,从而消除它们抑制细胞生长的功能,使细胞分裂加速,形成肿瘤。利用Tet-on系统首先稳定筛选获得了表达Tet-on系统调节元件rtTA的阳性细胞CHO-pTet-on,再通过稳定筛选又成功得到导入其反应元件的双阳性细胞CHO-pTet-on-pTRE2-SV40T-Hyg,经强力霉素诱导表达了目的基因SV40T,建立了Tet-on基因诱导表达系统的细胞诱导表达研究平台。