细胞信号肽酶复合体亚基1与牛病毒性腹泻病毒复制的相关性分析

旨在探明信号肽酶复合体亚基1(signal peptidase complex subunit 1,SPCS1)影响牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的作用。使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向SPCS1基因的sgRNA,克隆至慢病毒载体lentiCRISPR v2,连同包装质粒pSPAX2和pMD2.G转染至人胚肾细胞HEK-293T中,包装慢病毒并感染MDBK细胞,用嘌呤霉素筛选5代后获得敲低SPCS1蛋白后稳定表达的细胞,用Western blot检测SPCS1蛋白表达的情况;使用荧光定量PCR和免疫荧光分析检测BVDV感染SPCS1蛋白敲低细胞不同时间后5'非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA的水平和双链RNA(double-stranded,dsRNA)积累,利用倒置显微镜观察BVDV致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,根据Reed-Muench方法测定病毒滴度变化情况。结果：Western blot检测SPCS1蛋白表达量明显下降,成功构建SPCS1敲低(knockdown,KD)细胞;BVDV感染SPCS1 KD细胞后与对照Scramble相比,BVDV 5' UTR mRNA水平和dsRNA量均显著性降低(P < 0.01),CPE现象推迟并减弱,子代病毒滴度显著性下降(P < 0.01),最高降低95.8%。SPCS1敲低后显著性影响BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供理论依据。     

IPTG诱导浓度、时间对Asia I型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大。最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大。     

PRRSV GP5基因的原核表达及其免疫性分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的糖蛋白GP5含有中和表位,是检测用抗原和亚单位疫苗的首选蛋白。本研究将糖蛋白GP5基因截短后,克隆至表达载体pET-30a,转化大肠埃希菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,每升重组菌可纯化得到目的蛋白87.5mg。Western blot和间接酶联免疫吸附试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好免疫反应性。     

PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

建立了一种检测猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验法（IPMA），并组装成PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒。对该试剂盒的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验，并与国外IDEXX ELISA试剂盒进行了比较。结果显示，用该试剂盒检测PRRSV人工接种猪血清样品，第1周抗体阳性检出率为50％，从第2周起抗体阳性检出率均为100％，而对照组猪血清抗体检测均为阴性。该试剂盒重复性好，-20℃保存18个月稳定，与其他病毒参考血清无交叉反应，与国外IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83．3%。用该试剂盒对采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、上海等地13个猪场的520份正常猪血清样品进行了抗体检测，结果，4个猪场阳性率高达90％以上，仅有2个猪场为阴性，其余猪场阳性率为10％～57%。     

乌苏市高致病性禽流感血清学监测

高致病性禽流感对养禽业的危害十分严重。禽类在免疫后的抗体水平直接关系到养禽业的发展。用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验对高致病性禽流感抗体水平进行监测显得十分重要和必要。对乌苏市22个规模化鸡场的206份鸡血清样品进行了H5亚型禽流感(AIH5)免疫抗体的测定。所检206份血清样品中,有162份血清样品合格,占所检样品的78.6%,所抽样的规模化养鸡场AIH5疫苗的总体免疫水平合格。     

传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP3基因的克隆与原核表达

利用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因，将其克隆到表达载体pPRO^EX-HTa中，获得重组质粒命名为VP3／PA，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，插入的位置、大小和读码框均正确。SDS—PAGE检测表明，经重组质粒VP3／PA转化、诱导的受体菌E．coli DH5 α能表达结构蛋白VP3基因，约33 Ku，表达量达到了茵体总蛋白的33．9％，经Western blot等检测表明，诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV阳性血清发生特异性反应。这为IBDV血清学诊断方法的建立打下了基础。     

新疆部分地区马疱疹病毒1型感染的血清学调查

旨在了解新疆地区马疱疹病毒1型感染的流行现状和特点,本研究于2019—2020年从新疆乌鲁木齐、昌吉州、伊犁州、巴州16处规模化马场收集1 657份马血清样品,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行抗体检测,对不同地区、品种、性别及年龄马匹的马疱疹病毒1型抗体阳性率进行统计分析。结果显示,乌鲁木齐、伊犁州、昌吉州、巴州马疱疹病毒1型抗体阳性率分别为39.34%、22.56%、90.52%、5.00%;纯血马、混血马、哈萨克马、伊犁马、焉耆马、普氏野马的EHV-1抗体阳性率分别为20.34%、32.93%、44.92%、19.35%、5.00%、90.52%;普氏野马与家马的EHV-1抗体阳性率分别为90.52%和29.32%;家马中新疆本土品种马与引进品种马的EHV-1抗体阳性率分别为31.70%和25.50%;母马与公马的EHV-1抗体阳性率分别为38.84%和22.00%;处于幼年、青年、成年、老年阶段的马匹EHV-1抗体阳性率分别为35.37%、33.00%、34.31%、23.81%。结果提示,新疆乌鲁木齐、伊犁州、昌吉州、巴州规模化养殖场普遍存在EHV-1感染,且不同地区、品种、性别及年龄的马EHV-1感染率差异显著（P<0.05）。本研究为新疆地区EHV-1感染的探讨和防控工作提供调查数据。     

含EGFP基因的马疱疹病毒1型新疆株gE基因缺失株的构建

为筛选马鼻肺炎（equine rhinopneumonitis,ER）基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1（登录号：KF644579.1）目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒（CMV+EGFP+polyA）为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示：经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价（10^7.1TCID₅₀/0.1 mL）较原毒株（10^8.8TCID₅₀/0.1 mL）下降约10^1.7TCID₅₀/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。