奶牛乳房炎无乳链球菌的分离鉴定与特异、快速检测方法

[目的]了解新疆奶牛乳房炎病例中无乳链球菌的感染状况和生物学特性,建立特异、快速检测方法.[方法]采集新疆4个不同地区规模化奶牛场乳房炎奶样,分别用鉴别培养基和绵羊血琼脂平板进行无乳链球菌分离培养、形态学观察、生化试验、PCR鉴定、致病性和常用抗生素敏感性试验.[结果]从检测出的139份乳房炎阳性奶样中分离出无乳链球菌24株.所分离菌株培养特性与生化反应符合该菌特性;依据无乳链球菌16S rRNA基因序列设计引物扩增所得PCR产物在405 bp处出现特异性条带;分离菌株对青霉素、氯霉素、庆大霉素、红霉素、万古霉素、克林霉素、头孢西丁、环丙沙星均敏感,对四环素、强力霉素、复方新诺明耐药.[结论]Granada选择性培养基培养和PCR扩增均可用于乳房炎奶样中无乳链球菌的特异、快速鉴定;新疆乳房炎奶样中无乳链球菌感染率为17.27;.     

牛病毒性腹泻病毒E0基因原核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)C24V株接种MDBK细胞,提取病毒RNA,扩增出BVDV-E0基因,将所得片段与pET-28a表达载体连接,转化至BL-21大肠杆菌中,筛选阳性克隆,鉴定后证明pET-28a-E0原核表达载体构建成功。经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定,鉴定结果表明,目的蛋白在大肠杆菌中得以表达。     

赤羽病病毒间接荧光抗体快速检测方法的初步研究

以兔抗赤羽病毒重组核蛋白血清作一抗,利用间接荧光抗体法在AKAV感染的BHK-21培养细胞和攻毒的乳鼠脑组织中特异性地检测到了AKAV抗原,为赤羽病的病原学诊断提供了简便的检测方法。     

致病性大肠杆菌引起犊牛腹泻的诊治报告

致病性大肠杆菌引起犊牛腹泻的诊治报告冉多良，波拉提·哈布汗，魏新（新疆八一农学院畜牧分院，乌鲁木齐，８３００５２）１９８８年９月至１１月，新疆呼图壁奶牛场连续发生犊牛腹泻与死亡，经场兽医临床治疗，效果不佳，１０月中旬送病料到我院。现将我们的病原诊断和...     

传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点，经过酶切、测序分析，筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒，分别命名为pCAGG—gB、pCAGG—gC、pCAGG—gD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化，将纯化后的质粒转染293T细胞，用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明，目的蛋白得到了真实的表达。     

H5亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒载体的构建

经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

重组禽α疱疹病毒研究进展

禽α疱疹病毒可以引起多种家禽重要传染病,重组病毒是研究其基因组结构功能和新型基因工程疫苗的有效手段.文章综述了禽α疱疹病毒转移载体的构建和同源重组方法、感染性细菌人工染色体系统、基因缺失疫苗和重组活载体疫苗的最新进展.     

禽流感疫苗研究进展

近年来禽流感在一些国家和地区大规模暴发,不仅给养禽业造成了巨大的经济损失,而且还威胁到人类的生命健康,以疫苗免疫为主要手段的防控措施日渐得到广泛关注。本文综述了禽流感疫苗的研究现状,对比了各种疫苗的优缺点,介绍了我国禽流感疫苗研究的发展趋势。     

H9N2亚型禽流感病毒对海兰白鸡感染和传播特性的研究

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)对海兰白鸡的感染和传播特性,将80只4周龄海兰白鸡随机分为8组,每组10只,其中感染组5只,同居组5只,采用100~107EID50/0.4 m LH9N2 AIV以滴鼻和点眼方式攻毒,24 h后放入同居组。感染14 d内每天进行临床观察,采集咽拭子和泄殖腔拭子用于病毒分离,感染后7、10、14 d测定HI抗体滴度。结果表明:4周龄海兰白鸡感染H9N2 AIV后未出现明显的临床症状;感染剂量为100~101EID50/0.4 m L的感染组和同居组均未分离到病毒;感染剂量为102~103EID50/0.4 m L的感染组排毒期为2~6 d,同居组排毒期为4~6 d;感染剂量为104~107EID50/0.4 m L感染组排毒期为1~6 d,同居组排毒期为2~8 d;感染剂量为102~107EID50/0.4 m L感染组和同居组鸡分别于感染后7和10 d开始产生抗体,第14天感染组和同居组鸡的平均抗体滴度分别为(7.8±1.4)log2和(6.7±1.1)log2。结果显示该毒株使4周龄海兰白鸡全部感染的最低感染剂量为103EID50/0.4 m L,以106EID50/0.4 m L感染鸡,能刺激感染组与同居组产生较高的HI抗体,表明106EID50/0.4 m L H9N2亚型AIV能在海兰白鸡体内建立有效感染和传播。     

EIAV基因转移载体的优化

本研究在马传染性贫血病毒（EIAV）基因转移载体pcPPTPRE（＋）的基础上[含有报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）和人乙型肝炎病毒转录后调控元件（HARE）1,对其转录后调控元件和外源基因启动子进行优化。参考土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus,WHV）基因组序列和人巨细胞病毒增强子／鸡B—actin启动子序列（CAGp）,设计合成2对引物,分别扩增WHV转录后调控元件（WARE）和CAGp片段,正向插入pcPPTPRE（＋）获得重组质粒pcPPTWARE和pcPPTWCAG。将获得的EIAV转移载体pcPPTWARE和pcPPTWCAG以及pcPPTPRE（＋）,脂质体法分别转染人胚肾细胞HEK293和鸡胚成纤维细胞系DF-1,转染后12h、24h、36h、48h在荧光显微镜下观察特异性绿色荧光的表达。48h后收获细胞,利用流式细胞仪检测转染细胞中表达EGFP的阳性细胞。结果表明,在HEK293细胞中pcPPTWARE和pcPPTWCAG的阳性细胞平均百分率均极显著高于pcPPTPRE（＋）（P〈0．01）,pcPPTWCAG显著高于pcPPTWARE（P〈0．05）;pcPPTWCAG的平均道数值极显著高于pcPPTPRE（＋）和pcPPTWARE,pcPPTWPRE显著高于pcPPTPRE（＋）。在DF-1细胞中pcPPTWARE和pcPPTWCAG的阳性细胞平均百分率均显著高于pcPPTPRE（＋）,而pcPPTWARE和pcPPTWCAG的平均道数值均极显著高于pcPPTPRE（＋）,pcPPTWCAG显著高于pcPPTWARE。本研究利用WARE和CAGp优化构建了EIAV基因转移载体pcPPTWCAG,获得了较强的基因表达能力,为以鸡为宿主进行转基因研究提供了条件。