单股正链RNA病毒基因组5′非翻译区的结构与功能研究进展

单股正链RNA病毒是众多人畜共患病及动植物传染病的病原,其种类繁多,对人畜健康和农业经济生产影响重大。该类病毒基因组5′非翻译区(5′UTR)一级序列及各种高级结构在病毒的复制、转录、翻译过程中发挥重要调控作用,本文对一些代表种属单股正链RNA病毒的5′UTR进行介绍,且就其结构与功能的一般研究方法、主要进展和存在的问题进行了探讨。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒5'非翻译区-茎环结构的功能解析

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美株感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR将5'非翻译区(5'UTR)中部分一级序列进行系列突变,以改变5'UTR二级结构中的一保守茎部结构,从而解析PRRSV 5'UTR中结构与功能的关系.通过DNA转染MARC-145细胞观察突变体克隆的感染性,并通过免疫荧光及Northern blot来研究拯救后突变病毒的复制、转录特性,以及通过空斑形态学分析突变病毒的生长特性.结果表明,PRRSV 5'UTR中保守茎部结构的二级结构与病毒的拯救无直接关系,但其一级核苷酸序列却是PRRSV病毒复制所必需的,作者还找到直接调控病毒复制的核心位点.由此证实了5'UTR中调控PRRSV复制过程的必需序列,为进一步解析PRRSV复制过程的调控元件奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白翻译起始位点的研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N蛋白)的表达是通过非连续性转录合成的亚基因组(Subgenomic,sg)mRNA翻译而来。但位于亚基因组前导序列中的2个AUG均不能作为N蛋白翻译的起始位点,其翻译使用的是N开放阅读框(ORF)中的首个AUG,因此,本研究旨在感染性克隆的基础上研究N蛋白的翻译起始位点。作者实验室已有在ORF6和ORF7之间插入酶切位点的感染性克隆pORF673,该突变克隆中含有3个潜在的AUG,分别构建了pORF673中N蛋白的其中2个潜在的起始密码子AUG突变的全长克隆,转染Marc-145细胞。这些突变体都能够拯救出子代病毒,其中2个突变病毒的N蛋白的前11个氨基酸完全改变,这些突变病毒都能够在Marc-145细胞上稳定传代。经RT-PCR分析子代病毒的N基因序列及其亚基因组序列,结果表明N蛋白的翻译偏向于使用其ORF的第1个潜在的AUG。如果后者移码,则病毒可以自身修复,这是首次发现病毒有矫正ORF的功能。本研究为N蛋白N端插入标签作为标记疫苗以及进一步研究N蛋白结构与功能奠定了基础。     

PRRSV感染性克隆5’非翻译区序列缺失突变分析

在PRRSV感染性克隆pCBC2的基础上,通过突变PCR获得了病毒基因组5'UTR系列缺失的全长突变体克隆:pCBCM1、pCBCM3、pCBCM5、pCBCM7、pCBCM9、pCBCM45、pCBCM69、pCBCM100,随后将上述突变体体外转录成RNA之后转染MARC-145细胞,进行病毒感染性、复制和转录分析,以鉴定特定的缺失区的调控功能.结果显示,病毒5'UTR起始的第1个碱基是保持病毒感染性非必需的核苷酸;前45个碱基对病毒基因组的复制是非必需的.Northern-Blot结果显示pCBCM1亚基因组mRNA可以进行高效率的转录.而其余突变体的亚基因组转录受到严重抑制.由此证明,PRRSV 5'UTR的完整性对病毒意义重大,碱基的少量以及大部分缺失会对病毒产生极大的影响.     

poly(A)尾对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组感染性的影响

大部分单股正链RNA病毒的基因组末端含有poly（A）尾,这对病毒基因组RNA的感染性起着非常重要的作用。本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,通过突变PCR获得poly（A）尾长度分别为0、5、8、9、10、22、35的全长突变体克隆,经体外转录转染MARC-145细胞,观察细胞病变（CPE）,对于能产生CPE的突变克隆,抽提细胞上清中的病毒RNA,通过G-Tailing法鉴定子代病毒基因组的poly（A）尾长度。结果表明：1、poly（A）尾影响PRRSV基因组的感染性,且最小长度为10;2、PRRSV基因组poly（A）尾在感染细胞过程中能被修复。     

鸡瘟病毒载体研制及应用进展

鸡瘟病毒载体研制及应用进展袁世山，刘桂永，沈瑞忠，金虹，卢景良（中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室）重组疫苗特别是活病毒载体疫苗的出现，为改进现有常规疫苗带来了契机，痘苗病毒（ＶＶ）以其外一源基因容量大，忠实的翻译后处理而一度成为病...     

鸡痘病毒基因组酶切片段的克隆及酶谱分析

以鸡胚成纤维细胞培养的中国鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株，经蔗糖密度梯度离心法纯化，电镜观察示所得病毒为典型鸡瘟病毒颗粒。以蛋白酶Ｋ法抽提病毒基因组，电泳结果为典型的大分子量ＤＮＡ特征，经ＥｃｏＲＩ或ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄⅢ酶切，插入ｐＵＣ１９载体相应位点，经转化、筛选、鉴定后得相应酶切片段的基因组文库。对其中２３个克隆片段用双酶法进行酶谱分析，绘制出了相应克隆片段的酶切图谱，每个克隆片段中均有１～６个可以利用的插入位点。基因组文库的构建及部分克隆片段的酶谱分析为进一步筛选病毒复制非必需片段以构建重组疫苗表达载体乃至鸡痘病毒分子生物学的研究打下了坚实的物质基础。     

鸡痘病毒复制非必需区的筛选及酶切分析

本实验对鸡痘病毒２８２Ｅ４株基因组ＰｓｔⅠＨｉｎｄⅢ或ＢａｍＨⅠ片段进行了克隆、鉴定，并对部分克隆进行酶切分析，在此基础上对其中６个克隆插入Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒，构建了含报告基因的重组质粒。用其中的三个重组质粒以磷酸钙法共转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），其中有２个产生了蓝色空斑．经三次空斑纯化能稳定产生子代病毒．证明所使用ｐＦＢ１７６和ｐＦＨ１３３为病毒复制非必需片段，分别是２．９ｋｂＢａｍＨⅠ片段和４．７ｋｂ的ＨｉｎｄⅢ片段，并绘出了它们的物理图谱．     

猪繁殖与呼吸综合征病毒5'非编码区前导转录调控序列及其侧翼序列的结构与功能解析

为解析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5'非翻译区(5'UTR)的高级结构与功能,以北美株PRRSV感染性克隆为平台,通过定点突变PCR技术将其5'UTR中一特殊高级调控元件的一级序列进行突变,以改变其二级茎环结构,从而解析该结构的基因调控水平。将突变DNA克隆转染入BHK-21细胞后利用免疫荧光及RT-PCR试验来研究拯救后突变病毒的转录、翻译特性,及通过空斑形态学及病毒生长曲线分析突变病毒的生长特性。结果表明,PRRSV 5'UTR中该高级调控元件的顶端环结构为病毒复制所必需,其只可耐受2个核苷酸的突变;同时发现该调控元件中一保守的茎结构为病毒复制非必需。由此证实了PRRSV 5'UTR中调控病毒复制过程的必需高级结构,为进一步解析PRRSV复制调控元件奠定基础。