猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入细胞过程研究进展

作为动脉炎病毒科成员之一的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）,是一种严重危害世界养猪业的传染病病原。PRRSV如何侵入宿主细胞是病毒学的一个基本但却一直悬而未决的问题,明确该过程对优化设计PRRSV疫苗有重要指导意义。本文拟就PRRSV入侵细胞过程的国内外研究进展作一概述,重点展示细胞受体和病毒结合蛋白的研究动态。     

PRRSV强弱病毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)与致弱PRRSV的重组病毒,本研究在PRRSV致弱株APRRS的全长感染性克隆pAPRRS与HP-PRRSV感染性克隆pJX143的基础上,利用SOE-PCR技术将强弱毒的nsp2区域进行互换,构建了nsp2基因替换的强弱毒PRRSV嵌合感染性克隆.将构建的嵌合克隆转染MA104细胞,4d后观察到典型的细胞病变.通过RT-PCR和间接免疫荧光证明获得了强弱病毒株之间nsp2基因互换的嵌合病毒.这些嵌合病毒的构建和相应反向遗传操作平台的建立,为进一步研究HP-PRRSV的致病机制及相关疫苗的研发奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a/ORF5重叠区的分离

以两个不同基因型的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用SOE-PCR将I型PRRSV的ORF2～5a替换进II型PRRSV的相应区域,旨在将I型PRRSV的5a从ORF5中独立出来进而研究5a蛋白的功能,同时探讨两型PRRSV的结构蛋白结构与功能关系。研究结果表明,I型PRRSV的ORF2～5a序列能稳定存在于嵌合病毒基因组内,表达的相应蛋白能在II型PRRSV中发挥同样功能。本研究首次将PRRSV的ORF5a序列从ORF5中独立出来,为进一步研究5a蛋白的结构与功能提供了理论依据和基础材料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒5′非翻译区中一顺式结构因子对病毒感染必要性的分析

人们广泛认为动脉炎病毒的基因组5′非翻译区（untranslated region,UTR）在病毒基因组RNA复制、亚基因组mRNA转录和蛋白翻译过程中发挥关键作用,然而其结构与功能仍然在很大程度上不为人知。现基于2型猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染性克隆pAPRRS的基础,构建了一系列5′UTR的5′末端缺失突变体,利用RNA和DNA转染,分析了拯救病毒的遗传学与病毒学特征,发现拯救病毒的5′末端突变位点被一些不知来源的AU-rich外源序列所修复。基于T7启动子与CMV启动子转录起始位点的不同,我们人为引入一段GC-rich的序列以研究病毒的自我修复是否为模板依赖性,结果发现病毒的外源序列修复机制是非模板依赖的。通过二级结构预测分析发现,在PRRSV5′UTR中的第一个茎环结构是病毒感染性必不可少的。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4/ORF5基因区间的反向遗传操作:插入外源序列特性研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF4/ORF5基因间隔区有10个核苷酸(nucleotide,nt),为了探索ORF4/ORF5基因间隔区作为外源基因插入靶点的可行性,本研究通过突变PCR技术,获得一系列ORF4/ORF5间在不同位置插入不同碱基数及特定序列的突变体,随后进行了病毒拯救和复制分析。结果表明,在ORF4/5的10 nts间隔序列之前至少可插入13 nts;在间隔序列之后只能允许3 nts的插入;间隔序列之间能允许至少18 nts的插入,但允许插入的序列具有特异性,由此,暗示ORF4/5允许插入的外源序列与插入位置有关。本研究获得的诸多突变病毒为进一步研制PRRSV基因标识疫苗奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/6和ORF6/7重叠区的分离(人工)改造病毒的构建及鉴定

为了研究重叠序列在病毒繁殖周期中所起的作用以及更好地操作感染性克隆，将猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染性克隆ORF间（ORF5／6和ORF6／7）重叠区域分离并插入酶切位点，成功构建两个突变的全长质粒，随后进行了病毒拯救和复制分析。结果表明：（1）两个全长质粒均能够进行病毒拯救，并产生明显细胞病变；（2）突变病毒具遗传稳定性；（3）病毒空斑形态及生长曲线与亲本毒株近似。表明PRRSVORF间重叠碱基的安排方式对病毒的感染性是非必需的，获得的两株突变病毒为进一步研制PRRSV基因标识疫苗、研究PRRSV各编码蛋白功能奠定了基础。     

嗜水气单胞菌HEC毒素基因的克隆及酶谱分析

嗜水气单胞菌ＨＥＣ毒素是该菌重要的致病因子和保护性抗原。为了解其分子生物学特性，用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取了嗜水气单胞菌Ｊ－１株的染色体，经ＥｃｏＲＩ酶切、琼脂糖凝胶电泳后作Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ，用ＤＩＧ标记的ＨＥＣ毒素探针检测，其５．０ｋｂ的酶切片段呈阳性。回收该片段，与ｐＵＣ１９相连，转化大肠杆菌ＪＭ１０９。提取Ｘ－ｇａｌ平板上白色菌落的质粒，经大小比较、ＥｃｏＲＩ酶切分析及ＤＩＧ标记ＨＥＣ毒素核酸探针斑点杂交鉴定，获得ｐＨＥＣ１１等含５．０ｋｂ目的ＤＮＡ片段的重组质粒。ｐＨＥＣ１１质粒经酶切、电泳，证实目的ＤＮＡ片段中含有ＢａｍＨＩ、ＳｍａⅠ、ＰｓｔⅠ及ＰｖｕⅡ等酶切位点，并绘制了其物理图谱。同时还构建了若干亚克隆，为研制嗜水气单胞菌基因工程苗提供了目的基因片段。     

检测PRRSV—Ⅰ、PRRSV—Ⅱ和PCV-2多重PCR方法的建立及初步应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virns,PRRSV）欧洲株（PRRSV-Ⅰ）、北关株（PRRSV-Ⅱ）常与猪圆环病毒2型（Porcine Circorirnstype 2,PCV-2）呈混合感染,严重影响养猪业的经济效益。本文根据GenBank上已发表的PRRSV北美型（PRRSV-Ⅰ）、PRRSV欧洲型（PRRSV-Ⅱ）、圆环病毒2型（PCV-2）的基因组全序列,分别设计了3对能特异性扩增PRRSV-Ⅰ、PRRSV-Ⅱ和PCV-2的引物,建立并优化了可同时检测PRRSV-Ⅰ、PRRSV-Ⅱ和PCV-2三种病毒的多重PCR方法,通过对临床病料的检测,证实了此方法具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点,适合大量样本的分析与鉴定。利用该方法能在24h内对样品进行检测并获得结果,因此本方法的建立对这3种病毒的早期快速诊断有十分重要的意义。