猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

为快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),本研究针对PRRSV的N蛋白基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA作为标准品,设计并优化了检测PRRSV的TaqMan荧光定量PCR方法。应用该方法检测其它主要猪病病原,结果均呈阴性;针对PRRSV阳性RNA的检测灵敏度可以达到10拷贝,比常规PCR灵敏10倍～100倍;结果表明,本实验建立的PRRSV TaqMan荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。应用建立的方法测定攻毒猪血清中病毒的含量,免疫攻毒组和非免疫攻毒组在第7 d血清中病毒的载量差异不显著,而在第14 d差异显著,免疫攻毒组猪血清中病毒载量明显低于未免疫组。     

携带PCV-2 ORF2的感染性PRRSV克隆在Marc-145细胞表达的研究

为解析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)删除外源基因的机制,以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,构建在PRRSV全长基因组上同时包含其Nsp2区域缺失108nt及其ORF1与ORF2间插入猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2的全长cDNA pDCPV,将pDCPV转染Marc-145细胞,获得拯救病毒vDCPV。鉴定vDCPV的遗传稳定性发现,vDCPV比先前发表的只在PRRSV ORF1与ORF2间插入PCV-2ORF2获得的拯救病毒vCPV更具有遗传稳定性,这提示PRRSV删除外源序列的最主要机制是插入外源序列后导致基因组过长,由此可能影响N蛋白与基因组作用及其他结构蛋白包装过程。IFA结果显示,vDCPVP能微弱表达PCV-2cap蛋白。     

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并用检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。