猪细小病毒4型Taq Man荧光定量PCR方法的建立与应用

根据GenBank中发表的猪细小病毒4型(PPV4)全基因组序列,针对其结构蛋白VP2基因的保守序列,设计合成特异性引物及TaqMan探针,以VP2克隆质粒为标准品,通过对探针浓度、引物浓度、dNTP浓度、镁离子浓度以及退火温度进行调整,建立了PPV4的TaqMan荧光定量PCR.反应条件优化后,该方法在6.73×10...     

2007年中国部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析

 【目的】对采集自上海、江西、山东、江苏、河南和湖南等省的257份进行了PCV2的检测,确定中国PCV2感染情况及分子特征。【目的】设计一对针对PCV2 ORF2的引物,利用PCR对其进行PCV2基因组的检测,对PCV2阳性的样品,进行了ORF2的克隆、序列测定和分析。【结果】结果显示PCV2阳性率为24.51%（63/257）,并能从健康猪群中检测的阳性;各PCV2分离株间ORF2核苷酸序列同源性为84.4%～100%,氨基酸同源性为82.5%～100%,与所属群的不同而不同。【结论】中国有2个群的PCV2毒株在流行,以PCV2b群为主（70.97%,22/31）,但也有PCV2a群毒株（29.03%,9/31）的流行,同时PCV2流行的基因型没有明显的地域间差异。部分毒株符合高致病性PCV2的特征,暗示中国已存在高致病性PCV2的流行。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞传代毒株反向遗传系统的优化

反向遗传系统已成为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）结构与功能非常重要的手段,并且在设计基因工程疫苗中发挥不可替代的作用。因而,有效提高感染性克隆拯救病毒的效率和稳定性以及降低经济成本是一个急需解决的课题。本研究在已构建完成的高致病性PRRSV细胞传代毒株反向遗传系统（pAJXM）的基础上,做了以下三方面的工作：（1）将T7启动子换成hCMV（人类巨细胞病毒,Human cytomegalovirus）启动子,从而全长cDNA克隆不需经过体外转录成mRNA的过程,直接通过DNA转染MARC-145细胞拯救病毒;（2）研究hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间最佳的碱基数目,使体内转染获得的病毒基因组5末端序列为病毒的真实序列;（3）在病毒基因组3末端添加丁型肝炎病毒核酶（delta hepatitis virus ribozyme,HDVr）序列,体内转染获得的病毒基因组3末端的非病毒序列通过核酶自动去除。研究发现,基于DNA转染的反向操作系统是可行的,并且hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间的碱基数目设置为25和在病毒基因组3末端添加HDVr序列后,能够有效地提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率和稳定性。     

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。     

中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究

 【目的】对来自2006年猪病流行爆发地的组织样品进行多种病毒的检测,确定引起本次流行的致病病原及PRRSV的分子流行病学特征。【方法】利用（RT-）PCR对采集的样品进行PRRSV北美型和欧洲型、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）以及瘟病毒的检测,对PRRSV阳性的进行ORF5的序列测定并分析。【结果】检测到16份PRRSV北美型阳性样品,PCV2阳性样品2份,其它病毒均未检到。PRRSV ORF5序列分析表明笔者分离到的PRRSV株可分为2个群。【结论】（1）PRRSV与2006年肆虐中国养猪业的猪病流行有直接关系;（2）2006年PRRSV流行株主要是以JX0612株为代表,但不同遗传特征的PRRSV也在流行。     

检测猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针,以感PCV2的PK-15细胞培养上清的DNA提取物为模板,分别扩增499 bp和131 bp的片段,建立了检测PCV2的TaqMan荧光PCR方法。结果表明:TaqMan荧光PCR检测PCV2的最佳探针浓度为0.5 pmol·μL-1;TaqMan荧光PCR两步法操作快捷,扩增131 bp的引物PCF1101/PCR1232检测敏感性高(3.17×102拷贝·μL-1),重复性好。在诸多检测样品中,除检测到PCV2检测指标出现阳性外,猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV),日本乙型脑炎病毒(JEV),猪伪狂犬病毒(PRV),猪瘟病毒(CSFV)及PK-15细胞等检测指标均为阴性,表明特异性强;与普通PCR的检测结果(2/10)比较,本法的敏感性和对临床样品的阳性检出率(3/10)更高。上述研究表明,本方法快速、敏感、特异,具有很高的重复性,且可实时监测,能有效检测PCV2。     

套式病毒转录调控机制的研究进展

套式病毒又称巢状病毒(Nidovirus)属于有囊膜的单股正链RNA病毒,主要感染哺乳动物,少数感染禽类及无脊椎动物.近年来,套式(巢状)病毒目(Nidovirales)的成员越来越多.随着严重急性呼吸综合症(SARS)的爆发,冠状病毒科(Coronaviridae)又增添了几种新的冠状病毒,其中包括感染人的2种病毒[1-3].国际病毒分类委员会1996年规定套式病毒目只包括冠状病毒科(冠状病毒属和凸隆病毒属)和动脉炎病毒科,最近把罗尼病毒科(Roniviridae)也划归其中.     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株细胞传代研究

为研究猪源牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)生物学特性,将本实验室分离得到的SD0803毒株在马-达氏牛肾细胞(mardin-darby bovine kidney,MDBK)上连续传40代,提取第40代病毒基因组RNA,设计扩增及测序引物,用RT-PCR方法分5段扩增第40代病毒基因片段,并进行全长测序,利用DNASTAR软件进行序列拼接及分析,与亲代病毒SD0803序列比对分析;用Real-time PCR方法测定第1、10、20、30和40代细胞上清中的病毒复制效率,并绘制多步生长曲线。测序结果表明,第40代病毒与亲代病毒核苷酸序列的同源性为99.8%,氨基酸序列的同源性为99.6%,其中有23处发生核苷酸突变,14处为有义突变,氨基酸变化主要集中在E2和NS5B区域。多步生长曲线显示,传代病毒和亲本病毒均能在MDBK细胞上获得较高的复制效率,并有着相似的生长特性,复制效率基本一致。本次研究为研制猪源BVDV疫苗做好了物质储备,为下一步研究其致病性和抗原性奠定基础。     

异源5′非翻译区在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性拯救过程中的功能解析

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reporoductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）基因组5′非翻译区（untranslated region,UTR）对病毒复制转录等过程至关重要,但其发挥作用的机制尚不清楚。本实验室将欧洲型PRRSV 5′UTR替换入北美型PRRSV弱毒株感染性克隆pAPRRS的骨架中,构建pAPLV5。经过DNA转染入MARC-145细胞系中,两次传代后,拯救出嵌合病毒vAPLV5。通过对嵌合病毒的全长测序发现,嵌合病毒基因组较亲本病毒发生了碱基突变,突变主要集中于Nsp2和Nsp9位置。将Nsp9位置（病毒的RNA依赖的RNA聚合酶,RNA-dependent KNA povymerase,RdRp）的4处突变位点引入嵌合病毒的感染性克隆pAPLV5,所构建的4个突变嵌合克隆转染MARC-145细胞后无需传代即产生细胞病变（cytopathic effect,CPE）,且P0代病毒滴度较原嵌合病毒vAPLV5高。通过半定量负链和亚基因组检测发现,突变嵌合病毒的RNA合成水平也较亲本嵌合病毒高。由此推测PRRSV 5′UTR功能可能与RdRp相关,异源的5′UTR通过突变RdRp来发挥其调控作用,完成病毒拯救过程。     

RNA病毒的重组机制及其研究进展

RNA重组是RNA病毒普遍存在的变异方式之一,但仍有很多关键性问题尚未阐释清楚。目前认为重组机制主要有两种,复制型重组机制即模板转换（template-switch）,又称为copy-choice机制;另一种为非复制型重组机制,即断裂连接机制（breakage-religation）和类似于剪接的反酯作用（splicing-like transesterification）机制。由于重组在病毒进化变异过程中发挥着不同的作用,阐明重组机制有助于研究病毒进化变异和复制转录等生命周期过程。本文拟就RNA重组类型、重组机制、对RNA病毒重组的研究、重组的生物学意义及应用4个方面,综述RNA病毒重组机制及其研究进展。