应用枇杷二代测序数据进行染色体步移研究

【目的】枇杷基因组数据尚未公布,限制了枇杷分子生物学的研究。当前很多研究集中在上游转录因子和下游基因启动子之间的调控关系上,所以获得目的基因的启动子显得尤为重要。传统方法使用PCR方式进行染色体步移来获得启动子区域,耗时且难出结果。【方法】对‘火炬’枇杷进行二代测序,二代测序为双端测序,片段含盖200到500bp的序列。根据下游基因序列通过测序片段来实现染色体步移。使用现有程序Magicblast和新开发的Promoter_Scan脚本程序来快速获取目的基因启动子区域。Promoter_Scan对每对Reads构建10 bp的索引序列,先使用索引匹配目的基因,匹配后使用目的基因前30 bp序列再次匹配目标Reads,最后完成拼接。【结果】通过二代测序共获得61.77 GB的‘火炬’枇杷基因组数据,测序深度约为85倍。使用Magicblast检索匹配Reads耗时长,难以二次开发,需要手动拼接延伸,每个基因启动子挖掘需要9.5 h。新开发Promoter_Scan脚本程序通过两次匹配,能够更快更准确地找到启动子序列。对枇杷中8个基因进行启动子查找,向上延长2 000 bp序列平均需要拼接11.7次,耗时21.3 min。根据步移后的序列设计引物进行验证,结果显示:Sanger测序结果和预测的序列高度一致。【结论】使用Magicblast检索方式能够达到实验要求,不需要编程技能,但是耗时长。Promoter_Scan能够实现自动延伸,显著缩短启动子挖掘时间。本研究中的两种方法不仅可以用于枇杷分子生物学的研究,对其他未公布基因组数据的物种同样适用。     

液相色谱-串联质谱法对有机肥中19种磺胺的测定

建立测定有机肥中19种磺胺的液相色谱-串联质谱法。有机肥样品用酸化乙腈超声提取,经无水硫酸镁、PSA、C18净化,涡旋离心后定容,液相色谱-串联质谱法分析19种磺胺。结果表明,添加浓度为20.0~250 μg·kg^-1时,有机肥中磺胺添加回收率为73.0%~111.0%,相对标准偏差为0.2%~13.0%;磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪的检出限为6 μg·kg^-1,定量限为20 μg·kg^-1;其他15种磺胺类药物的检出限为3 μg·kg^-1,定量限为10 μg·kg^-1。     

寄主植物中抑制十字花科黑腐病菌Ⅲ型分泌系统小分子化合物的鉴定

 寻找抑制植物病原菌III型分泌系统的植物源活性小分子化合物,是研发生物安全农药的重要途径之一。本研究采用水煮提取法从十字花科黑腐病菌寄主植物满身红萝卜中提取分离活性小分子化合物,利用高效液相-质谱联用解析出活性物质的单体结构。然后用荧光素酶基因luxAB构建融合报告系统以及定量PCR检测活性物质对十字花科黑腐病菌III型分泌系统的抑制效果,最后采用剪叶接种和压渗接种的方法研究活性小分子物质对十字花科黑腐病菌的生防作用。研究表明,植物鞘氨醇和二氢鞘氨醇对十字花科黑腐病菌III型分泌系统基因的转录表达有一定程度的抑制作用,但是对I、II、IV型分泌系统基因的表达没有明显的抑制作用。植物鞘氨醇在XCM1上影响菌的生长,而二氢鞘氨醇不影响菌的生长。同时,还发现这两种物质能显著降低Xcc在寄主植株满身红萝卜上的病害症状以及能够使Xcc在非寄主植物辣椒上引起过敏反应的能力丧失。该研究结果为深入研究小分子化合物对十字花科黑腐病菌III型分泌系统的作用机制及后续开发植物源抑制剂提供了一定的理论依据。     

牦牛瘤胃微生物抗生素抗性基因对3种外源性刺激因子的响应

通过给牦牛投喂硫酸头孢喹肟(CEF)、盐酸二氟沙星(DIF)和黄曲霉毒素B1(AFB1),并进行瘤胃微生物宏基因组测序,旨在揭示这3种外源性刺激因子对抗生素抗性基因(ARGs)种类、抗性类型、抗性机制等的影响,对于深入研究微生物抗性组特征和抗性机制具有重要价值。选取15头牦牛,随机分5组。Cef组和Dif组分别根据说明书推荐剂量按体重计算、灌服CEF 1 mg·kg^-1和DIF 1 mL·kg^-1;E1组和E2组分别按采食量投喂AFB120、60μg·kg^-1;C组为对照组。处理7 d后,采集瘤胃液,提取DNA,Illumina HiSeq测序,对reads counts进行标准化得到TPM值,并进行方差分析。结果显示,对照组共获得132种ARGs,分属30种抗性类型,其中,四环素类tetQ和tetW基因丰度较高;Cef组tetW基因丰度增加(P<0.05),Dif组tetQ丰度增加(P<0.05);Cef组四环素类和头孢菌素类抗性基因丰度增加(P<0.05),Dif组四环素类和氨基香豆素类抗性基因丰度增加(P<0.05),E1组氨基香豆素和青霉烯类抗性基因丰度增加(P<0.05),E2组青霉烯类、头孢菌素类等9类抗性基因丰度均增多(P<0.05);Dif组Erm基因23S核糖体RNA甲基转移酶丰度增加(P<0.05),E2组中ATP结合盒超家族等3种抗性机制相关基因的丰度增加(P<0.05);3种因子均显著增加四环素类ARGs宿主的种类。结论:瘤胃是蕴含丰富ARGs的储藏库,其中,四环素类抗生素抗性基因tetQ和tetW是主要的ARGs。不仅CEF和DIF使部分ARGs的种类、抗性类型以及耐药机制相关酶等的丰度升高,增加瘤胃微生物的耐药性,而且AFB1也具有类似作用,且高剂量AFB1对抗性类型的影响范围较抗生素大。这3种因子还导致携带四环素类ARGs宿主微生物的种类数量增加,从而强化横向转移机制,加快ARGs传播,增强微生物对四环素类的耐药性。     

饰面板用三聚氰胺甲醛树脂的改性

利用邻苯二甲酸二烯丙酯(diallyl phthalate,DAP)取代二乙二醇进行三聚氰胺甲醛树脂(melamine formaldehyde resin,MF)的改性,并用改性前后的MF树脂进行浸渍胶膜纸和饰面刨花板的制备。通过树脂基本性能测试、傅里叶红外光谱(FT-IR)和差式扫描量热(DSC)分析及饰面板材表面性能表征,得出以下研究结论:1) DAP的加入并未对MF树脂的外观性能、固体含量和化学结构产生明显影响,但增加了MF树脂的黏度,并提高了其固化温度; 2) DAP的加入明显提高了MF树脂浸渍胶膜纸的抗拉强度,当DAP取代二乙二醇达到100%时,胶膜纸抗拉强度从3.00 MPa提高至5.33 MPa,提高幅度明显,但胶膜纸韧性有所下降,当DAP添加量为20%质量分数时,胶膜纸的韧性和抗拉强度均有所增加,抗拉强度提高幅度为133%; 3)在未添加任何耐磨剂的前提下,DAP的加入明显改善了饰面板的耐磨性能,当DAP添加量为40%和60%时,磨耗值最低,从79.7 mg/(100 r)分别下降至61.4和62.3 mg/(100 r),且饰面板在测试350 r后表面无露底现象。DAP的加入对饰面板的耐冷热循环、耐水蒸气、耐剥离、耐污染和耐腐蚀等性能未产生影响。     

可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析

【目的】可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病（Botryosphaeria dieback）,影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛选获得552个潜在的具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组预测蛋白总数的4.3%,其编码蛋白长度集中于101—400 aa。信号肽统计分析表明,其信号肽长度以18—20 aa的序列最为集中,信号肽长度为20 aa的蛋白数量最多。信号肽中使用频率最高的氨基酸为丙氨酸;非极性、疏水的氨基酸使用频率最高,占氨基酸总数的60.2%。其信号肽的-3至-1位置上的氨基酸相对保守,切割位点属于A-X-A类型,可被Sp I型信号肽酶识别并切割。336个分泌蛋白具有功能注释,其功能较多集中于细胞壁降解有关的酶类以及致病相关蛋白,并且这些蛋白在分子量、等电点、脂肪族氨基酸指数等方面均存在差异。通过蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统证实,挑选的9个分泌蛋白信号肽均具有分泌活性。qRT-PCR检测结果表明,所选分泌蛋白基因在该病菌侵染初期的表达发生变化。【结论】利用生物信息学分析技术从可可毛色二孢全基因组中共预测获得552个经典分泌蛋白。其信号肽氨基酸长度分布广泛,氨基酸组成中非极性、疏水的氨基酸使用频率最高。功能注释主要集中在细胞壁组分降解相关的酶类、致病侵染相关的坏死诱导相关蛋白以及几丁质结合蛋白等。     

百香果品种‘紫香1号’果实糖、酸和维生素成分分析

为深入了解‘紫香1号’百香果成熟果实中的可溶性糖、有机酸和维生素组分及含量,采用高效液相色谱法测定各组分的含量。结果表明:‘紫香1号’百香果中的可溶性糖主要为葡萄糖、果糖和蔗糖,各糖分之间差异显著,其中蔗糖含量最高,达38.52mg/g,属蔗糖积累型;有机酸包括苹果酸、丙二酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸,各有机酸之间差异显著,以柠檬酸含量最高,达0.995 mg/g,属柠檬酸优势型;维生素包括维生素A、维生素B1、维生素C和维生素E,各种维生素之间差异达显著水平,其中维生素E含量最高,为430.61 mg/kg。可见,‘紫香1号’百香果含有丰富的可溶性糖、有机酸和维生素,具有较高的甜度和酸度值,故果实成熟时鲜食口感酸甜,风味浓郁。