基于全基因组预测和分析花生果腐病原菌分泌蛋白

【目的】为分析花生果腐病病原菌-新孢镰刀菌的侵染机制并筛选可用基因。【方法】以全基因组测序结果为基础,根据分泌蛋白与效应因子的特点,采用SignalP、TMHMM、WoLF PSORT及NetGPI等软件一步步筛选,对新孢镰刀菌全基因组12 756条蛋白序列进行了分泌蛋白预测和功能分析。【结果】新孢镰刀菌全基因组编码蛋白中有701条序列具有典型的分泌蛋白特征,占蛋白总数的5.49%,其长度主要分布在101～700个氨基酸范围内。信号肽的分析结果表明,信号肽-3和-1位置的氨基酸相对保守,其切割位点属于典型的A-X-A型。对分泌蛋白功能预测结果表明,656个分泌蛋白获得了功能注释,其功能主要涉及碳水化合物的运输、代谢过程,蛋白翻译后修饰和氨基酸代谢、运输过程。分泌蛋白中效应蛋白预测结果表明,新孢镰刀菌分泌蛋白中共有161个潜在的效应蛋白。【结论】对新孢镰刀菌分泌蛋白的有效预测和功能分析,为筛选新效应蛋白,明确其致病机理,筛选寄主抗性基因奠定了基础。同时为花生果腐病抗性品种选育和综合防治提供理论依据。     

小麦条锈菌萌发夏孢子cDNA文库中编码分泌蛋白的序列预测

【目的】植物与病原菌互作过程中,涉及许多可以与植物受体蛋白相互识别、引发植物防卫反应的病原菌激发子或其他致病因子,其中多数为分泌蛋白,深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制。【方法】通过SignalP v3.0、TMHMM v2.0、TargetP v1.1、Protcomp v6.0 4个软件,对陕西省农业分子生物学重点实验室构建的小麦条锈菌萌发夏孢子cDNA文库中854条EST序列进行分泌蛋白预测。【结果】得到具有可溶性分泌信号肽的蛋白编码序列33条,占测定序列的3.86%,其中最小长度为196 bp,最大为1 096 bp,分泌信号肽切割位点基本位于15~42个氨基酸,平均为37个氨基酸。【结论】预测得到的分泌蛋白编码序列,可以作为小麦与条锈菌互作过程中的激发子和致病因子备选基因来进一步研究。     

全基因组预测褐环乳牛肝菌的分泌蛋白

褐环乳牛肝菌作为针叶树种上重要的外生真菌,为宿主植物提供营养元素和水分,在此过程中,对于该菌分泌蛋白发挥的作用机制尚不清楚。利用Signal P、Prot Comp等预测程序对褐环乳牛肝菌中18 303条蛋白质序列进行分泌蛋白找寻,明确其含有327个分泌蛋白,同时,对上述分泌蛋白的氨基酸大小分布、信号肽长度、信号肽切割位点等进行分析,明确该菌分泌蛋白的氨基酸长度集中于51~450 aa,信号肽长度以17~21 aa的序列最为集中,其信号肽切割位点均属于A-X-A类型。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了褐环乳牛肝菌分泌蛋白的预测,分泌蛋白的信号肽切割位点类型与其他已经报道的致病疫霉、粗糙脉孢霉、禾谷炭疽菌等分泌蛋白信号肽切割位点一致。研究结果为进一步解析分泌蛋白在该菌为宿主植物提供营养过程中发挥的作用机制提供重要的理论支持。     

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae VdLs.17）分泌组预测及分析

 【目的】预测并分析大丽轮枝菌基因组范围内的分泌蛋白,为大丽轮枝菌分泌蛋白致病机理的研究奠定基础。【方法】利用已公布的大丽轮枝菌全基因组序列,组合使用生物信息学软件SignalP、TargetP、TMHMM、Big-pi和PROSITE,预测大丽轮枝菌基因组范围内所有分泌蛋白,定义为分泌组。统计分析分泌组中蛋白N-端信号肽特点;应用碳水化合物活性酶类数据库和病原菌-寄主互作蛋白数据库对分泌组蛋白进行注释,预测分泌组中潜在果胶酶、纤维素酶和病原菌寄主互作蛋白;利用真菌激发子的保守结构域,预测分泌组中潜在的激发子蛋白集;应用BLASTP程序比较分析大丽轮枝菌和黑白轮枝菌分泌组,获得大丽轮枝菌相对于黑白轮枝菌特异的分泌蛋白。【结果】大丽轮枝菌分泌组共有922个蛋白。信号肽分析表明,以19个氨基酸为信号肽的蛋白数目最多,非极性氨基酸丙氨酸的出现频率最高,而有带电侧链的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的出现频率最低,信号肽的-3和-1位置上的氨基酸相对保守。大丽轮枝菌分泌组含有158个潜在的碳水化合物活性酶类,其中,包括10个果胶水解酶和14个果胶裂解酶;190个潜在的病原菌-寄主互作蛋白、97个含有RxLx[EDQ]模体的蛋白和52个富含半胱氨酸的小分子量分泌蛋白;58个相对于黑白轮枝菌分泌组特异的蛋白。【结论】本文建立了预测大丽轮枝菌分泌组蛋白的方法。分泌组蛋白信号肽长度具有高度的变异性,氨基酸组成多为脂肪族氨基酸,序列在C-端结构域较为保守。分泌组中包含大量潜在的果胶降解酶、病原菌-寄主互作蛋白、RxLx[EDQ]模体蛋白和富含半胱氨酸的小分子量蛋白等致病相关蛋白。     

茄子枯萎病菌致病效应因子的预测分析

【目的】本研究为了获得由尖孢镰刀菌引起的茄子枯萎病菌的致病相关效应蛋白。【方法】通过生物信息学的方法进行预测分析,包括SignalP、TMHMM、TargetP、ProtComp、与Pathogen-Host Interaction(PHI)数据库进行比对分析等方法。【结果】从茄子枯萎病菌Fomg14004全基因组16 485个蛋白质序列中,经SignalP v4.1分析后得到1601个具有信号肽的蛋白序列;然后经过TMHMM v2.0分析得到1481个跨膜数小于2的蛋白序列;1481个具有信号肽的蛋白经过TargetP v1.1分析得到1449个定位为S的蛋白序列;最后经过ProtComp v9.0分析,得到1376个蛋白质定位于细胞质中的分泌蛋白序列。1376个蛋白中,富含cysteine(大于或等于6)的蛋白序列共733个,其中219个蛋白序列的multiple tandem repeats大于或等于9。将219个蛋白序列和PHI数据库进行比对筛选,并挑取小于300个氨基酸的蛋白序列,共筛选到29个致病相关候选效应因子。【结论】本研究最终从16485个蛋白序列中筛选得到29个候选致病效应因子。为进一步研究该病菌的效应因子致病功能提供基础,也为其他病原菌效应因子的预测分析提供方法参考。     

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析*

 利用信号肽分析软件SignalP v3.0,亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1.01,GPI-锚定位点软件big-PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2.0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框(ORF)最小值为78bp,最大值为7849bp,平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15～45个氨基酸之间,平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述,主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类,提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。     

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析

利用信号肽分析软件SignalP v3．0，亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1．01，GPI-锚定位点软件big—PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2．0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框（ORF）最小值为78bp，最大值为7849bp，平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15—45个氨基酸之间，平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述，主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类，提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。     

基于全基因组序列预测里氏木霉QM6a的分泌蛋白

里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a为重要的产纤维素酶工业生产菌株,为明确其内存在的分泌蛋白,对该菌分泌蛋白进行预测,并明确其特征。利用SignalP、ProtComp等5个软件对该菌中9 143条蛋白质序列进行分泌蛋白预测,并对上述分泌蛋白的氨基酸大小分布情况、信号肽长度及其切割位点等性质进行分析。里氏木霉中含有分泌蛋白356个,其氨基酸长度、信号肽长度与其他植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A-X-A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、细菌以及卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了里氏木霉分泌蛋白的预测,也证明了分泌蛋白的信号肽切割位点具有物种保守性特点。     

香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组规模分泌蛋白的预测与分析

为了明确香蕉枯萎病菌热带4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)与香蕉互作的分子机理,本研究利用SignalP、WoLF PSORT、TargetP、TMHMM和big-PI Predictor等软件,对Foc TR4全基因组22 487条蛋白质氨基酸序列进行了经典分泌蛋白的预测分析。结果表明,Foc TR4全基因组编码蛋白质中有1 054个经典分泌蛋白,占编码蛋白质总数的4.7%。蛋白质特征分析结果表明,其氨基酸序列长度集中在100~500个氨基酸,信号肽长度集中在17~22个氨基酸,信号肽切割位点以SPaseⅠ型为主。功能预测分析结果表明,有463个经典分泌蛋白获得了注释,主要涉及糖代谢、水解酶活性等。碳水化合物酶类(CAZymes)的分析结果表明,有281个分泌蛋白为CAZymes,其中以GH家族最多。此外,利用Secretome P软件对Foc TR4非经典分泌蛋白进行了分析,发现有9 216个蛋白质氨基酸序列,占编码蛋白质总数的41.0%。     

尖孢镰刀菌甜瓜专化型基因组规模分泌蛋白的预测与分析

利用Signal P、Wo LF PSORT、TMHMM、big-PI Predictor、Target P和Secretome P等软件,对尖孢镰刀菌甜瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis,FOM)全基因组26 811条蛋白质氨基酸序列进行了分泌蛋白的预测分析。结果表明,FOM全基因组编码蛋白中有1 145个经典分泌蛋白,占编码蛋白总数的4.3%;有8 471个非经典分泌蛋白,占编码蛋白总数的31.6%。对经典分泌蛋白特征进行分析,发现其氨基酸长度集中在100~600个氨基酸,信号肽长度集中在17~22个氨基酸。对经典分泌蛋白的功能预测分析表明,有605个分泌蛋白获得了注释,主要涉及糖代谢、转运过程、过氧化氢代谢和生物合成等。对碳水化合物酶类(CAZymes)进行分析,结果表明有277个分泌蛋白为CAZymes,占经典分泌蛋白总数的24.2%。     

Pathogenicity and Gene Expression Pattern of the Exocrine Protein LtGH61A of Grape Canker Fungus

【Objective】Grape canker disease, caused by Botryosphaeria genus fungi, occurs in a wide range of grape-producing areas in China and seriously threatens the yield and quality of grape. The objective of this study is to analyze the function of a hypothetical exocrine protein, LtGH61A, in grape canker fungus Lasiodiplodia theobromae, and to lay a foundation for in-depth analysis of the pathogenic mechanism and disease control of grape canker fungus.【Method】The signal peptide of LtGH61A protein was predicted by SignalP 4.0. The function of LtGH61A protein was predicted by the homologous comparison and functional annotation. The exocrine characteristic of LtGH61A protein was analyzed by yeast complementary experiment. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression of LtGH61A in vegetative hyphae and different infection processes. The expression of LtGH61A was inhibited through RNA interference (RNAi). The effect of LtGH61A protein on the pathogenicity of L. theobromae was analyzed by in vitro inoculation test of grape shoots. The effect of LtGH61A protein on the hyphal growth rate of L. theobromae was analyzed by comparing the colony diameter.【Result】Amino acid sequence analysis predicts that the N-terminal of the LtGH61A protein contains a signal peptide with a length of 18 amino acids. The gene function annotation suggests that LtGH61A belongs to glycoside hydrolase family 61 (GH61) and can degrade cellulose as a substrate. Yeast complementary experiments showed that the signal peptide of LtGH61A protein could guide the secretion of invertase of yeast YTK12. Compared with the vegetative hyphae, the expression of LtGH61A was increased significantly at the infectious stages, and the mRNA accumulation of LtGH61A at 48 h post inoculation was 19 times of that in the vegetative hyphae. Moreover, RNAi lines were constructed for LtGH61A and two lines RNAi-LtGH61A1 and RNAi-LtGH61A2 were confirmed by qRT-PCR. The results of in vitro inoculation test of wild-type and RNAi transformants on wounded grape shoots showed that the lesion length caused by both RNAi-LtGH61A1 and RNAi-LtGH61A2 was significantly shorter than that of wild type (WT) CSS-01s, which was about 55% of WT, indicating that LtGH61A affected the pathogenicity of L. theobromae. The colony diameter comparison showed that compared with WT, the colony diameter of RNAi-LtGH61A1 and RNAi-LtGH61A2 transformants became smaller, about 85% of WT, indicating that LtGH61A affected the hyphal growth rate of L. theobromae.【Conclusion】LtGH61A affects the pathogenicity and hyphal growth of grape canker pathogen. LtGH61A protein can be secreted outside the cell. The expression level of LtGH61A during infectious stages is significantly increased, suggesting that LtGH61A can destroy the host plant tissue by exerting its own enzyme activity function, thus promoting pathogen infection.     

葡萄霜霉菌糖基水解酶基因的表达模式与功能分析

【目的】克隆葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）糖基水解酶（glycosyl hydrolase,GH）基因（PvGH）,分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式,研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡（PCD）以及影响烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）侵染的能力,为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材,采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长,并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析;利用酵母信号肽诱捕系统（SST）验证PvGH的分泌活性;利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式;同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白,分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致,长度为1 092—1 392 bp,分别编码364—464个氨基酸,与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构...     

多杀性巴氏杆菌基因组分泌蛋白的预测分析

分泌蛋白对于细菌自身的生命活动以及在介导病原体与宿主之间相互作用的过程中发挥着重要的作用,深入研究分泌蛋白将有助于明确细菌的生命活动及与病原微生物互作的分子机制.利用多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)基因组学研究成果,结合信号肽分析软件SignalP v3.0、跨膜螺旋结构软件TMHMM v2.0、亚细胞器蛋白定位软件PSORTb和GPI-锚定位点软件GPI-SOM这4个软件,对多杀性巴氏杆菌2105个编码蛋白的ORF进行预测分析,最终获得了136个分泌蛋白.对其信号肽长度、氨基酸组成、相应ORF长度进行了统计.运用Blast P对其功能进行同源性分析,发现11个蛋白为多杀性巴氏杆菌所特有,这对多杀性巴氏杆菌的临床诊断具有一定的潜在应用价值.     

酿酒酵母分泌蛋白组的计算机分析

 结合计算机技术和生物信息学的方法，采用组合的信号肽分析软件SignalP v3.0、TargetP v1.01、Big-PI predictor和TMHMM v2.0对已公布的6 700个酿酒酵母（Saccaromyces cerevieiae）基因的N-端氨基酸序列进行信号肽分析，同时系统分析了信号肽的类型及结构。结果表明，在6 700个酿酒酵母蛋白中，163个为Sec-信号肽分泌蛋白，经Sec途径分泌。在163个分泌蛋白中，有47个的信号肽没有典型的N-区，仅有H-区和C-区，其余116个分泌蛋白的信号肽包含完整的3个区，即N-区、H-区和C-区。比较了酿酒酵母与白假丝酵母菌(Candida albicans)分泌蛋白信号肽的氨基酸组成顺序，表明酿酒酵母与白假丝酵母菌的信号肽的氨基酸组成和顺序差异很大，两者信号肽长度分布范围、氨基酸种类及其出现频率大体一致。在酿酒酵母分泌蛋白中出现了少数氨基酸组成完全一致的信号肽，为进一步确认具有相同信号肽的分泌蛋白是否具有同源性，分别采用BLAST 2 SEQUENECES 和CLUSTAL W 对具有相同信号肽的分泌蛋白进行了序列比对。结果表明具有相同信号肽的分泌蛋白同源性非常高，氨基酸组成也非常保守。由此可以推断，编码这些分泌蛋白的基因属于旁系同源基因（paralogous）。酿酒酵母作为一种模式生物，以其诸多的优点，被认为是表达真核外源蛋白的首选宿主。对酿酒酵母进行基因组水平的分泌蛋白及信号肽结构的分析，可更好地利用该宿主表达分泌型的外源蛋白研究提供参考信息。     

Computational Analysis of Signal Peptide-Dependent Secreted Proteins in Saccharomyces cerevisiae

Computer based software such as the SignalP v3.0, TargetP v1.01, big-PI predictor and TMHMM v2.0 were combined to predict the signal peptides, and the signal peptide-dependent secreted proteins among the 6 700 ORFs in genome of Saccharomyces cerevisiae. The results showed that 163 proteins were the secreted ones containing signal peptides, and they were secreted via Sec pathway. Among the 163 predicted secreted proteins, the signal peptides of 47 secreted proteins included only the H-domain and C-domain, without N-domain, but the signal peptides of other 116 secreted proteins included all the three domains. There were differences in the constitution of signal peptides between the secreted proteins of S. cerevisiae and of Candida albicans, but the length and amino acids types of their signal peptides were similar in general. Few of the same signal peptides occurred in the secreted proteins of S. cerevisiae genome, and the homology could be compared among the secreted proteins with the same signal peptides. The BLAST 2 SEQUENECES and CLUSTAL W were used to align the two protein sequences and multi-protein sequences, respectively. The alignment result indicated that homology of these sequences with the same signal peptide was very highly conservative in amino acid of complete gene. The effect of the signal peptides in S. cerevisia on expression of foreign eukaryotic secreted proteins is discussed in this paper.     

飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′的抗体制备及组织定位

【目的】LmKnickkopf3-5′(LmKnk3-5′)是飞蝗（Locusta migratoria）蜕皮发育中重要的表皮蛋白。本文旨在制备LmKnk3-5′特异抗体并对其进行组织定位,为LmKnk3-5′生物学功能研究提供蛋白水平的证据,同时为进一步深入探究LmKnk3-5′与其他表皮蛋白在飞蝗表皮形成过程中的协同作用打下基础。【方法】首先比对飞蝗Knickkopf(Knk)家族4个基因LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和LmKnk3-5′的氨基酸序列,选取LmKnk3-5′的3段特异抗原序列R1、R2和R3,设计包含BamH I、Hind III酶切位点的引物,以LmKnk3-5′全长cDNA为模板,PCR获得LmKnk3-5′的特异抗原片段;然后将特异抗原片段与pET-32a经双酶切、T4连接酶连接、测序验证、成功构建重组质粒后,转入BL21（DE3）表达菌株中,加入IPTG（终浓度0.5 mmol·L^-1）低温（16℃）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况;接着扩大培养可在菌体裂解液的上清中表达重组融合蛋白的大肠杆菌,提取蛋白并用Ni-NTA对其进行纯化,之后再用纯化后的重组特异抗原免疫小鼠4次,获得anti-LmKnk3-5′多克隆抗体,ELISA法对其进行效价检测,并用Western blot法检测其特异性。取飞蝗5龄若虫第8天表皮,制备石蜡切片,通过免疫组化法对LmKnk3-5′蛋白进行组织定位。【结果】通过氨基酸序列比对,选取LmKnk3-5′的特异抗原区域R1、R2和R3,分别包含208、147和131个氨基酸残基,蛋白理论分子量分别为24.0、17.0和14.8 kD。酶切连接后,成功获得 pET-32a-R1、pET-32a-R2 和pET-32a-R3重组质粒。诱导表达检测,发现只有含pET-32a-R2的表达菌在菌体裂解液的上清液中大量表达重组蛋白。将其扩大培养纯化后获得 R2重组融合蛋白,免疫小鼠取抗血清进行效价检测,抗体效价高达1﹕512 000,可满足抗体使用需求。Western blot结果表明,注射dsLmKnk3-5′后飞蝗体壁LmKnk3-5′的蛋白表达显著减少,表明anti-LmKnk3-5′抗体特异性良好。免疫组化试验结果表明,表皮蛋白LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁皮细胞及新表皮中均有分布,特别是新合成的外表皮顶端。【结论】成功获得飞蝗LmKnk3-5′多克隆抗体,证明其特异性良好。LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁新合成的外表皮顶端分布较多。研究结果为飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′功能研究提供了蛋白水平的证据。     

主要气象因子对哈巴河县草地螟种群数量变动的影响

【目的】研究主要气象因子与草地螟种群数量变动的相关关系。【方法】2015和2016年通过诱虫灯,在哈巴河县研究主要气象因子对草地螟种群数量变动的影响,并进行系统分析。【结果】6月中旬和7月中旬草地螟越冬代成虫和第一代成虫达到种群数量的高峰期。逐步回归分析得知,平均温度、最高温度、最低温度、平均空气相对湿度、日照时数和降雨量是影响草地螟种群数量变动的主要气象因子。最高温度、最低温度的增大,限制草地螟数量的增多。【结论】哈巴河县6~8月的平均空气相对湿度和平均温度有利于草地螟生长发育,故该时期是草地螟在研究区域猖獗发生期。