布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因克隆测序及表达分析

为研究布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因序列和表达情况及其与生长发育的关系,本实验运用克隆测序方法检测CRTC1、CRTC3基因CDS区,并进行生物信息学分析;运用qRT-PCR技术检测不同组织和不同月龄的mRNA相对表达量;并用免疫组化技术对蛋白进行定位分析。结果显示:克隆测序获得的布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因CDS区分别为1773 bp和1725 bp,分别编码590、575个氨基酸;运用生物信息学分析后发现CRTC1、CRTC3结构稳定性差,为亲水性、偏酸性蛋白;进化树显示与牛、瘤牛、山羊和绵羊的同源性高(>80%),蛋白互作网络图显示CRTC1、CRTC3蛋白与FoxO基因家族、AMPK家族等基因相互作用强。qRT-PCR结果显示CRTC1、CRTC3基因分别在睾丸和脂肪中mRNA相对表达量最高(P<0.01),在肌肉组织中亦有表达。在肌肉组织中,CRTC1、CRTC3基因mRNA相对表达量随着年龄的增加逐渐降低;免疫组化显示CRTC1、CRTC3蛋白主要在肌肉组织的肌原纤维中表达。以上结果表明,CRTC1、CRTC3基因调控肌纤维生长发育,进而参与肌肉生长发育相关调节。     

CnAβ基因对大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

过敏是人和养殖动物常见的疾病，而且发生的频率呈现逐渐增加的趋势。为了深入了解过敏反应的机制，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建钙调磷酸酶A beta （calcineurin A beta，CnAβ）基因敲除的大鼠RBL-2H3细胞株，并探讨CnAβ基因对RBL-2H3细胞生长及脱颗粒的影响。选取大鼠CnAβ基因第一外显子为敲除靶点，设计并合成3个单导向RNA （single guide RNA，sgRNA），构建pX459-CnAβ-sgRNA质粒，并用脂质体3000将构建好的质粒转染到RBL-2H3细胞内；利用嘌呤霉素对转染细胞进行筛选，通过DNA测序验证获得CnAβ基因敲除的RBL-2H3细胞株；并检测CnAβ基因缺失对细胞增殖和脱颗粒的影响。结果表明，成功构建了CnAβ单基因敲除的大鼠RBL-2H3细胞株；CnAβ基因缺失对RBL-2H3细胞增殖、细胞的颗粒形成以及颗粒含量无显著影响，但显著抑制由细胞表面受体介导的RBL-2H3细胞脱颗粒作用。该研究结果有助于深入了解动物过敏性疾病的发生机制，为动物过敏性疾病的预防提供了理论基础。     

枳漆酶基因家族鉴定及其响应盐胁迫的表达分析

漆酶(LAC)是植物木质素生物合成中催化木质素单体聚合的关键酶，在调控植物生长发育和胁迫响应中发挥着重要作用。对枳漆酶基因家族进行鉴定和分析，并探究其在盐胁迫下的表达模式，可为进一步研究枳漆酶基因功能提供重要的参考信息。采用生物信息学手段鉴定枳漆酶基因家族成员，对其家族成员的理化性质、基因结构、系统进化关系、启动子顺式作用元件等进行分析，并通过qRT-PCR方法分析其盐胁迫表达模式。结果表明，枳基因组中共有20个LAC基因家族成员，其中18个分布在5条已知染色体上，2个分布在未知染色体上，被预测定位到细胞膜和细胞核中；共有6～14个外显子，5～13个内含子，9～11个motif;系统进化树分析结果显示，20个枳LAC基因家族成员与17个拟南芥LAC基因家族成员共分成7个亚组，20个枳LAC基因家族成员分布在其中的6组；20个枳LAC基因家族成员与拟南芥LAC基因间存在19对共线性关系；启动子区域含有24种顺式作用元件，其中厌氧诱导元件、干旱响应元件和茉莉酸甲酯响应元件数量最多；16个枳LAC基因在盐胁迫下显著上调表达，推测枳漆酶基因参与了盐胁迫响应。     

稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8的特性分析

 有性生殖在真菌的生活史和进化过程中具有重要作用,而交配型基因是控制有性生殖的关键因子。前期研究发现稻曲病菌(Villosiclava virens)MAT1-2型菌株中包含MAT1-2-1和MAT1-2-8两个交配型基因,但是它们如何调控稻曲病菌有性生殖依然不清楚。本文研究了它们在不同侵染和生长发育时期的表达模式和编码的蛋白结构特性。研究表明MAT1-2-1在侵染不同阶段一直下调表达;而MAT1-2-8在侵染早期(5 dpi)上调表达,在侵染后期下调表达。与营养菌丝阶段比较,MAT1-2-1和MAT1-2-8在有性发育过程菌核形成、菌核萌发、子座原基形成和子座成熟4个阶段的表达量都是下降的,在菌核形成阶段表达量最低。生物信息学分析显示MAT1-2-1和MAT1-2-8具有磷酸化位点,为非分泌蛋白,无明显的跨膜结构域。蛋白同源比对分析表明MAT1-2-1与香柱菌(Epichloë typhina)的MAT1-2-1同源性最高,而MAT1-2-8与绿僵菌(Metarhizium)的MBR_08192蛋白同源性最高。进一步研究发现MAT1-2-1和MAT1-2-8能够互作,并分别主要定位在细胞核和细胞基质中。通过质谱技术鉴定到MAT1-2-1的一些候选互作蛋白,如假定Ran交换因子Prp20/Pim1(KDB12229.1)、假定rRNA处理蛋白Ebp2(KDB12923.1)及组蛋白H1(KDB12711.1)等。因此,以上结果为研究稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8调控有性生殖的生物学功能奠定了基础。     

耐热抗根肿病萝卜胞质雄性不育多基因聚合新品种CHR18003的选育

新品种"CHR18003"是经过回交、杂交的方法育成的耐热抗根肿病萝卜胞质不育多基因聚合的F1代杂交组合。母本来源于萝卜胞质不育抗根肿病材料"CCR11239"与抗根肿病材料"CCR11240"经6代回交育成BC_6代萝卜胞质不育抗根肿病"CCR17000";母本不育性的保持系为抗根肿病材料"CCR11240",经过9代自交获得自交系"CCR17001";父本来源于耐热白菜品种"夏阳"与抗根肿病材料"CCR11240"杂交,经6代自交获得自交亲和系CHR17002,经CCR17000×CHR17002,获得新品种CHR18003。该品种经品比试验、多点试验和生产示范,每667 m~2平均产量6 625.00 kg,比对照品种夏阳增产10.70%,病情指数3.52比对照45.62降低42.10,表现高抗(HR)。2019年通过新品种登记。     

菊花绿变病植原体在中国的发生及分子鉴定

对内蒙古农业大学校园内表现花器绿变症状的菊花样品进行采集和DNA提取,应用植原体16S rRNA基因和rp基因的引物进行巢式PCR扩增,从感病样品中分别扩增得到了长度均约为1.2 kb的片段。序列一致性分析表明,菊花绿变植原体16S rRNA基因与翠菊黄化植原体匈牙利风信子株系(GenBank登录号MN080271)、印度玉米株系(KY565571)、印度繁缕株系(KC623537)和印度马铃薯株系(KC312703)的核酸一致性最高,为99.9%,rp基因序列与翠菊黄化植原体立陶宛洋葱株系(GU228514)的核酸一致性最高,为99.8%。基于16S rRNA基因和rp基因构建系统进化树时发现,菊花绿变植原体均与16SrI-B亚组成员聚为一起。16S rRNA基因相似性系数分析表明,菊花绿变植原体与洋葱黄化植原体(AP006628)的相似性系数最高为1.00,洋葱黄化植原体(AP006628)在分类上属于16SrI-B亚组。因此,我们可以确定该菊花绿变植原体属于16SrI-B亚组。这是我国首次报道菊花绿变病的发生。     

基于InDel分子标记的云南地方稻籼粳属性与表型性状相关分析

[目的]明确云南地方稻资源的籼粳属性及籼粳基因频率与表型性状间的相关性,为有效利用云南地方稻资源改良水稻品种提供理论依据.[方法]利用39对InDel籼粳特异性标记对来自云南12个地州69个县区的406份云南地方稻资源进行籼粳属性分析,通过计算云南地方稻资源在39个InDel位点上的籼粳基因频率,确定其籼粳类型;并对倒伏性、芒长、颖尖色、谷粒形状、株高、穗颈长、穗长、有效穗数、剑叶长、剑叶宽、每穗总粒数、每穗实粒数、一次枝梗数、二次枝梗数、千粒重、结实率、谷粒长和谷粒宽等18个表型性状进行调查,分析籼粳基因频率与表型性状的相关性.[结果]406份云南地方稻资源中有303份籼型稻(典型籼稻、籼稻和偏籼),占74.63%,其中典型籼稻77份、籼稻214份、偏籼12份;中间型资源11份,占2.71%;粳型稻(典型粳稻、粳稻和偏粳)有92份,占22.66%,其中典型粳稻36份、粳稻54份、偏粳2份.籼粳基因频率与表型性状的相关分析结果表明,粳型基因频率与穗颈长、谷粒宽、芒长、穎尖色、穗长、剑叶长、每穗总粒数、一次枝梗数、二次枝梗数、谷粒长和谷粒形状等11个表型性状呈极显著相关(P<0.01,下同),其中与谷粒宽(r=0.374)的正相关性最高,与谷粒形状(r=-0.429)的负相关性最高.[结论]云南地方稻资源存在明显的籼粳分化,InDel分子指数法所划分的7种籼粳类型在406份资源中均有出现,且其籼粳属性的分化与多个表型性状存在极显著相关性,尤其与谷粒宽(极显著正相关)和谷粒形状(极显著负相关)的相关性最高.因此,利用云南地方稻资源进行籼、粳稻定向改良及选育时应综合考虑谷粒宽和谷粒形状2个表型性状.     

疣粒野生稻保护、遗传特性及利用研究进展

疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)是稻属中保存较多原始性状特征的种类,对病害、虫害及非生物胁迫的抗性良好,尤其是高抗白叶枯病,蕴含大量优良基因,既可作为抗病、抗虫、耐旱和耐盐碱基因发掘及水稻育种的优良抗源材料,也可作为稻作高蛋白、高赖氨酸等改良稻米品质育种的优异种质资源;但疣粒野生稻(GG基因组)与栽培稻(AA基因组)亲缘关系较远,其遗传特性研究和发掘利用远落后于普通野生稻等其他野生稻.文章通过综述疣粒野生稻分类和命名、优异性状、遗传特性及其在水稻种质资源创新与利用等方面的研究进展,并探讨疣粒野生稻研究和利用过程中存在的困难,指出当前疣粒野生稻赖以生存的原生境不断遭到破坏,其生存形势已十分严峻,若现存的居群得不到有效保护,将会造成更多的资源流失;此外,疣粒野生稻基因组的复杂程度限制了其功能基因及基因家族的研究,同时增加了同源基因克隆的难度和准确度,致使疣粒野生稻有利基因的发掘和利用进程缓慢,以疣粒野生稻为亲本的育种研究非常有限.因此,今后要从以下3个方面加强疣粒野生稻研究:(1)重视疣粒野生稻的保护,加强保存、保护措施研究;(2)借助现代生物技术,包括第三代高通量测序技术、蛋白组学分析和代谢组学技术等开展疣粒野生稻优异性状调控机理研究,加强抗病、抗虫、耐旱及耐阴等功能基因的发掘.(3)加强疣粒野生稻杂交障碍和杂交后代不育研究,寻求克服杂交障碍及挽救杂交后代的方法,促进疣粒野生稻在水稻育种中的应用.     

黄沙鳖β-防御素基因克隆及其表达分析

[目的]明确β-防御素在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用,为开展黄沙鳖绿色病害防治及促进其养殖业健康发展打下基础.[方法]运用RACE克隆黄沙鳖β-防御素基因(Hs-BD1)cDNA序列,采用SignalP-5.0、PredictProtein、PSIPRED、Robetta和Clustal X等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测Hs-BD1基因在黄沙鳖不同组织中的表达特征及细菌感染前后的表达变化.[结果]Hs-BD1基因cDNA序列全长493 bp,包括72 bp的5'非编码区(5'-UTR)、201 bp的开放阅读框(ORF)及220 bp的3'非编码区(3'-UTR).Hs-BD1基因编码66个氨基酸残基,包括22个氨基酸残基组成的信号肽区、3个氨基酸残基组成的前肽区和41个氨基酸组成的成熟肽区.其中,成熟肽区具有6个保守的半胱氨酸残基(31Cys、58Cys、38Cys、52Cys、42Cys和59Cys)及位于C1和C2间的甘氨酸残基(Gly),即Hs-BD1基因属于β-防御素家族.Hs-BD1氨基酸序列与中华鳖β-防御素16的相似性最高(93.9%),基于β-防御素序列相似性构建的系统发育进化树也显示黄沙鳖与中华鳖和西部锦龟聚为一支,其亲缘关系相对较近.6个保守的半胱氨酸残基分别以C1-C5、C2-C4和C3-C6的连接方式形成3个二硫键;Hs-BD1成熟蛋白三级结构是由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成.Hs-BD1基因在黄沙鳖肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,在心脏、肠道、肌肉、脑组织和表皮中的相对表达量均较低;以温和气单胞菌攻毒后,Hs-BD1基因在黄沙鳖脾脏中的相对表达量呈上升—下降—上升—下降的变化趋势,在攻毒后第3和36 h共出现2个表达峰值,对应的相对表达量分别是攻毒前(0 h)的20.8和10.6倍,差异均极显著(P<0.01).[结论]Hs-BD1基因在黄沙鳖的多个组织中均有表达,尤其在肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的相对表达量较高,且可被温和气单胞菌感染诱导表达,说明Hs-BD1基因在黄沙鳖抵抗病原感染的过程中发挥调控作用.     

南美蟛蜞菊WtActin1基因克隆及表达稳定性分析

[目的]克隆南美蟛蜞菊肌动蛋白基因(WtActin1),并进行生物信息学及表达稳定性分析,为南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因表达及调控研究提供可靠的内参基因.[方法]RACE克隆WtActin1基因,通过在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列进行分析,并利用实时荧光定量PCR检测该基因在不同组织及温度胁迫下的表达情况.[结果]克隆获得的WtActin1基因cDNA全长1682 bp(GenBank登录号MN485900),其中5'非编码区(5'-UTR)170 bp,3'非编码区(3'-UTR)378 bp,开放阅读框(ORF)1134 bp,编码377个氨基酸残基.WtActin1蛋白分子量为41725.81 Da,理论等电点(pI)为5.31,不稳定性指数(II)为37.48,亲水性的平均值(GRAVY)为-0.166,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域和无信号肽,主要存在于细胞质中,具有Actin蛋白家族的典型特征结构,其二级结构主要由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,三级结构同源模型为嵌合肌动(3ci5.1.A),与莴苣、橡胶草和洋蓟的同源蛋白三级结构高度相似.WtActin1基因与其他植物Actin基因核苷酸序列相似性在86.4%以上,其推导氨基酸序列相似性在94.0%以上.从基于Actin氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树可看出,WtActin1与同为菊科的莴苣LsActin7亲缘关系最近,与传统分类学相吻合,其次是菊科的橡胶草TkActin1和锦葵科的棉花GhActin.WtActin1基因在南美蟛蜞菊根、茎、叶和花中的表达量均无显著差异(P>0.05,下同),且在高、低温胁迫下与正常温度处理的表达量也均无显著差异.[结论]WtAtin1基因属于Actin基因家族成员,在不同组织及温度胁迫下均能稳定表达,可作为内参基因用于南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因研究.