基于CRISPR/Cas9技术的法尼醇X受体缺失株的构建及其对HeLa细胞增殖的影响

试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体（FXR）基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,以PX459质粒为载体,构建真核重组表达质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,再用实时荧光定量PCR检测HeLa细胞FXR基因敲除稳定株中FXR的表达量,并用Western blotting方法鉴定HeLa细胞FXR基因敲除效果。最后用结晶紫染色试验检测FXR基因敲除对HeLa细胞增殖的影响。结果显示,经测序后,3对sgRNA位置与方向均正确插入到PX459质粒载体内,成功构建出重组表达质粒PX459-sgRNA;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,转染后筛选出的细胞中FXR蛋白不表达,表明构建出稳定敲除FXR基因的HeLa细胞株;结晶紫试验结果发现,FXR基因敲除的HeLa细胞染色深度明显低于正常HeLa细胞,FXR基因敲除HeLa细胞孔D_{595 nm}值极显著低于野生型HeLa细胞孔（P<0.01）,说明HeLa细胞FXR基因敲除株的增殖能力较正常HeLa细胞显著降低。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源FXR基因敲除细胞株,且FXR基因敲除对癌细胞增殖具有显著抑制作用,为研究FXR的功能和作用机制提供了细胞模型,并为研究FXR在相关癌症发生发展中的作用奠定了基础。     

TGFβ2和PPP3CA基因在黔北麻羊性腺轴组织表达及对卵巢颗粒细胞的调控研究

旨在对转录组测序中单羔组对多羔组TGFβ2和PPP3CA基因的上、下调结果进行验证，并探究黔北麻羊TGFβ2和PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞的调控机制。本研究以单、多羔黔北麻羊母羊为试验对象。通过RT-qPCR技术检测TGFβ2与PPP3CA基因在单、多羔黔北麻羊性腺轴中的表达水平；构建目的基因真核表达载体。培养黔北麻羊卵巢颗粒细胞，并利用脂质体转染法将pEGFP-N3-TGFβ2、pEGFP-N3-PPP3CA重组质粒导入卵巢颗粒细胞，检测培养基中雌二醇（E2）、孕酮（P4）的浓度。利用CCK-8和Annexin V-FITC法检测TGFβ2、PPP3CA基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响。随后，利用RT-qPCR从细胞水平检测超表达TGFβ2、PPP3CA基因对TGFβ2、PPP3CA、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因表达的影响。RT-qPCR结果表明，TGFβ2与PPP3CA基因在被检测的组织中均有表达，且在单羔组中的表达量普遍高于多羔组；免疫荧光法证实，所培养的细胞为黔北麻羊卵巢颗粒细胞；TGFβ2与PPP3CA基因真核表达质粒导入细胞后，在极显著提高TGFβ2与PPP3CA基因表达的同时，能够极显著地抑制卵巢颗粒细胞中FSHR、GnRHR、BMP4、TIMP3基因的表达（P<0.01）。细胞增殖与凋亡结果显示，TGFβ2与PPP3CA基因能够促进颗粒细胞凋亡，抑制其增殖。酶联免疫吸附试验结果表明，TGFβ2与PPP3CA基因能够显著促进E2的分泌，但对P4的分泌无显著影响。本研究成功构建了TGFβ2、PPP3CA基因真核表达载体，荧光定量结果表明，超表达TGFβ2、PPP3CA基因抑制了繁殖相关基因的表达，提示TGFβ2、PPP3CA基因对山羊繁殖相关基因表达有一定的影响。为进一步研究TGFβ2、PPP3CA基因对黔北麻羊繁殖力的影响提供基础数据。     

PK-15细胞的TPL2基因敲除有利于口蹄疫病毒和塞内卡病毒复制

旨在构建TPL2（MAP3K8/COT）基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2^-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒（FMDV）和塞内卡病毒（SVA）复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA（sg RNA）,合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹（Western blot）方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID₅₀评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2^-/-细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素（IFN）和IFN刺激基因（ISG）的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA感染的PK-15-TPL2^-/-细胞中干扰素途径的激活状态。TPL2基因敲除PK-15细胞系中TPL2基因发生了碱基插入突变和碱基缺失突变,构建的细胞系中均未检测到TPL2蛋白质表达。测定并比较了FMDV和SVA感染的PK-15和PK-15-TPL2^-/-细胞中病毒含量,表明TPL2基因敲除显著促进了FMDV和SVA的复制。同时,RT-qPCR进一步表明与FMDV和SVA感染期间的PK-15细胞相比,PK-15-TPL2^-/-细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达明显降低。综上所述,本研究成功构建了TPL2基因敲除的PK-15细胞系,与对照细胞相比,TPL2基因的敲除更利于FMDV和SVA的复制,这可能与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表达的抑制有关。本研究提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为在动物和疫苗开发过程中编辑细胞系以提高病毒产量的有效工具,本结果为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向,也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。     

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因敲除的猪回肠上皮（immortal pig intestinal-2I,IPI-2I）细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体（pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5）共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞（片段敲除效率为15.5%）,其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。     

鸡Apob基因组织表达与CRISPR/Cas9敲除系统的构建

旨在探究Apob基因在鸡肝脂质代谢过程中的功能。本研究对鸡Apob蛋白进行理化性质分析；利用RT-qPCR检测Apob基因在4周龄黄羽肉鸡组织中的表达情况，每组设置3个重复，进行3次平行试验。根据鸡Apob蛋白关键结构域，在Apob基因外显子设计3对sgRNA，构建Cas/gRNA载体；将重组质粒转染DF-1细胞后，利用T7核酸内切酶I （T7 endonuclease I，T7EI）酶切法和TA克隆测序法筛选敲除活性位点并计算敲除效率。利用RT-qPCR检测基因敲除后亚克隆细胞中Apob基因mRNA表达情况。结果表明，鸡Apob的相对分子质量为523.356 ku，平均亲水性为-0.300，为稳定的蛋白质，并且该基因主要在鸡的肝、肾和小肠组织表达。敲除载体转染至DF-1细胞后，T7EI酶切发现，Cas/gRNA6、Cas/gRNA7和Cas/gRNA8三个位点均可发挥敲除活性，TA克隆测序结果表明，三者的敲除效率分别为33.3%、65%和80%。同时，RT-qPCR结果显示，转染Cas9/gRNA7、Cas9/gRNA6、Cas9/gRNA8的细胞中Apob基因mRNA表达水平约分别下调99.96%（P<0.01）、85%（P<0.01）、47%（P<0.05）。综上所述，本研究揭示了鸡Apob基因在组织中的表达特点和蛋白的理化性质；成功构建了鸡Apob基因CRISPR/Cas9敲除载体，并筛选出最佳敲除位点，获得了Apob基因敲除的亚克隆细胞，为进一步探索Apob基因在鸡肝中的功能奠定了基础。     

Annexin A2基因敲除MDCK细胞系的构建

应用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除MDCK细胞中的Annexin A2基因,并验证其是否为ε毒素在MDCK细胞表面的受体。根据Crispr/Cas9靶点设计原则设计靶点,构建PALentiCRISPR v2重组质粒。借助Crispr/Cas9技术,将构建好的质粒转染至MDCK细胞中,用嘌呤霉素筛选敲除Annexin A2蛋白的MDCK细胞株,并通过测序和Western blot验证敲除效果。通过细胞毒性试验验证MDCK细胞膜表面的Annexin A2蛋白是否为ε毒素的受体蛋白。测序结果和Western blot结果表明,通过Crispr/Cas9技术成功敲除了MDCK细胞的Annexin A2基因,但细胞毒性试验结果表明,敲除Annexin A2基因并不能减弱ε毒素对MDCK细胞的毒性。结果表明,Annexin A2蛋白不是ε毒素在MDCK细胞表面的受体,研究结果为今后MDCK细胞其他蛋白的敲除提供了试验方法,构建的Annexin A2基因敲除的MDCK细胞也为Annexin A2蛋白引起的其他疾病的研究奠定了基础。     

猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建1株猪TRIM56基因敲除的PAM-KNU细胞系，并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)疫苗毒株中的应用。根据猪TRIM56基因组外显子区域设计合成2对特定的向导RNA引物，将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞，经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养；通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定，最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系，利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID₅₀)以及Western blot检测PRRSV增殖情况。结果显示，TRIM56敲除细胞系构建成功，该敲除细胞系中sTRIM56基因编码区第929～2 120位1 192个碱基缺失，未检测到sTRIM56...     

梅山猪LH-β基因真核表达系统的构建及体内外转染表达效果的研究

将克隆的梅山猪LH-β基因亚克隆到真核表达型载体VR1020上，通过质粒PCR的方法在转化子中筛选阳性克隆，用BamH I、BglⅡ双酶切鉴定重组子。得到的重组真核表达质粒转染Cos7细胞株，RT—PCR检测猪LH—β表达情况。然后用VPLH—β质粒、VR1020分别肌肉注射小鼠，研究了小鼠的生殖特性情况。结果显示：通过质粒PCR和双酶切分析，得到猪LH—p基因以正确方向插入的重组真核表达质粒VPLH—β。重组质粒VPLH—β经脂质体介导转染Cos7细胞，培养不同时间后提取mRNA进行RT—PCR，发现转染细胞RNA中含有与LH—β基因对应的mRNA；结果表明已成功构建了PLH—β的真核表达质粒，能正确转录表达LH—β。动物试验结果显示PLH—β免疫小鼠后的各项指标均高于对照处理。克隆构建的猪VPLH—β质粒能发挥明显的生殖生理调节作用，可较好地促进雌性动物的排卵、怀孕和正常产仔。     

MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

【目的】 构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO)，研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)复制的影响。【方法】 根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】 试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】 本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。     

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究

试验旨在研究伪狂犬病病毒（PRV）在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。     

凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响

本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞（PK-15）ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC^-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异;RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL-1β mRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID₅₀检测子代病毒感染力的滴定。结果表明：两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-ASC^-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC^-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC^-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC^-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-ASC^-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC^-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。     

ALG5对猪流感病毒复制的影响

在实验室前期利用猪肾细胞（PK-15）CRISPR/Cas9全基因组敲除文库（PK-15-GeCKO）筛选到猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶（ALG5）的前提下,深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA（gRNA）的质粒LentiGuide-puro-ALG5,并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮（NPTr）细胞系,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平,通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID₅₀和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时,检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示：获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系（ΔALG5）,ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖,过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后,也可以抑制猪流感毒株F26的复制,无毒株特异性。本研究表明,ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子,为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。     

CRISPR/Cas9介导的绵羊胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素基因敲除研究

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因突变可引起动物出现"双肌"性状,提高产肉性能。利用CRISPR/Cas9技术制备MSTN基因敲除的绵羊胎儿成纤维细胞,为制备MSTN基因敲除羊提供材料。设计构建4个靶向MSTN基因的CRISPR/Cas9载体,脂质体转染细胞后,通过SURVEYOR分析和测序等方法对敲除效率进行检测,采用极限稀释法挑选稳定敲除的细胞系。试验成功构建了4个靶向MSTN基因的CRISPR/Cas9载体,细胞转染后,测序结果显示pX330-target 1和pX330-target 4载体作用的靶位点处出现突变,SURVEYOR分析检测其在靶位点产生切割的效率分别为24.20%和10.18%。通过极限稀释法,获得12个MSTN基因突变的细胞克隆,其中1个为纯合突变。序列比对发现靶位点处有小片段碱基插入或缺失突变,部分会出现移码突变。成功利用CRISPR/Cas9系统实现了绵羊MSTN基因敲除,证明该系统可有效应用于绵羊基因编辑,产生的突变细胞系为制备MSTN基因敲除羊提供了材料。     

GnIH过表达载体构建及其对小鼠睾丸间质细胞的作用研究

本试验通过构建GnIH过表达载体,探究其对小鼠睾丸间质细胞（TM3细胞系）的凋亡效应及睾酮合成的调节作用。从6~8周雄性小鼠睾丸组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR扩增并纯化GnIH基因,应用T4连接酶将其连入PLVX-IRES-ZsGreen1载体,进一步转化到感受态菌中,通过PCR、双酶切及测序鉴定后提取质粒。随后将构建好的重组质粒转染TM3细胞系72 h,分为空质粒组和GnIH过表达组,通过显微镜观察细胞荧光、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法、ELISA法和流式细胞术检测GnIH表达水平、细胞凋亡率及相关凋亡基因表达变化、睾酮分泌水平和睾酮合成酶基因表达水平。结果显示,GnIH扩增片段序列与参考序列一致,将GnIH过表达质粒转染至TM3细胞系72 h后,可见高强度绿色荧光,过表达组中GnIH基因水平极显著升高（P<0.01）,表明GnIH过表达载体构建成功且在TM3细胞系中高表达。转染72 h后,与空质粒组相比,过表达组中细胞凋亡率极显著升高（P<0.01）,凋亡基因P53和Bax/Bcl-2表达量比值也极显著升高（P<0.01）。与空质粒组相比,过表达组中睾酮浓度极显著降低（P<0.01）。与此同时,睾酮合成相关酶基因P450 scc mRNA表达量极显著降低（P<0.01）,StAR、3β-HSD和P450c17 mRNA表达量显著降低（P<0.05）,17β-HSD mRNA表达量在两组间无显著性差异（P>0.05）。综上所述,在体外培养的TM3细胞中过表达GnIH能诱导TM3细胞凋亡、抑制睾酮分泌且降低睾酮合成相关酶的基因表达水平,推断GnIH在小鼠睾丸间质细胞生长和睾酮合成过程中发挥负调控作用。本研究可为揭示GnIH在雄性哺乳动物生殖调控过程中的作用提供科学理论依据。     

敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID_(50)。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I~(-/-)),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I~(-/-)的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID_(50)测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。     

Sox2基因真核表达载体的构建及转Sox2基因绵羊骨髓间充质干细胞系的建立

Sox2是多能干细胞的主要标记之一,有研究发现高表达Sox2基因的神经干细胞作为供体细胞进行核移植时具有较高的重编程能力。本研究旨在通过对绵羊骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymal stem cells,BMSC) Sox2基因进行外源性增强表达,以期提高其重编程能力,从而改善动物体细胞克隆效率。试验提取绵羊胎儿生殖腺组织RNA,以其为模板克隆Sox2基因cDNA序列,装入真核表达载体pEGFP-N1,构建出pEGFP-N1-Sox2表达载体。经脂质体转染将重组质粒转染入绵羊BMSC,经G418与荧光标记双筛选后挑选单克隆并扩增培养。测序鉴定表明,克隆得到绵羊Sox2基因CDS区全长,重组质粒构建成功;荧光检测表明,成功建立表达Sox2基因的绵羊BMSC系。本研究得到了高表达Sox2基因的绵羊BMSC系,为提高体细胞克隆过程中的重编程效率提供了新思路。     

基于CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株及对IFN-β的影响

利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。首先,制备Cas9表达慢病毒,感染RAW264.7细胞,通过Puromycin抗性进行初步筛选,PCR法进行鉴定。其次,设计3条特异性识别TRIF基因的sgRNA(sgTi1、sgTi2、sgTi3),将其转入稳定表达Cas9蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察转入效果,PCR和Western blot法验证基因敲除情况。最后,挑选基因敲除效果最佳细胞株,经TRIF激活剂诱导后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测IFN-β表达水平。结果显示:感染后的RAW264.7-Cas9细胞Cas9基因扩增产物升高,说明成功获得稳定表达Cas9基因的RAW264.7细胞。含目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9细胞后,荧光显微镜下可明显观察到目的基因已成功导入;PCR结果显示,与对照组比较,分别导入sgTi1、sgTi2、sgTi3的3组RAW264.7细胞TRIF表达均受到抑制,Western blot进一步验证3组RAW264.7细胞TRIF蛋白表达均下降且sgTi1组下降最显著,说明TRIF基因敲除成功。经TRIF激活剂诱导,与RAW264.7-Cas9-NC细胞比较,敲除TRIF基因后RAW264.7细胞IFN-βmRNA水平受到明显抑制。结果表明:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。     

藏羊HSP27基因过表达和沉默载体构建及对卵泡发育的功能初步分析

为了深入探究HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的作用,本研究选择健康的（3~4岁）经产藏母羊6只,屠宰获得卵巢组织进行藏羊HSP27基因克隆,利用生物信息学方法分析HSP27基因CDS区序列,构建HSP27基因过表达及沉默载体,分离培养藏羊卵巢颗粒细胞,将构建的载体按不同分组进行细胞转染试验即空白组、过表达载体组、沉默载体组、阴性对照组,每组设3个复孔。显微镜观察各转染组培养0、24、48、72 h的细胞形态变化及细胞计数,RT-PCR检测各转染组HSP27、GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量。结果,试验成功克隆藏羊HSP27基因,其CDS序列长度为618 bp,编码203个氨基酸。试验成功构建藏羊HSP27基因过表达及沉默载体;将构建的载体转染至卵巢颗粒细胞,随着培养时间的递增各转染组间细胞形态发生改变,过表达载体组细胞由长梭状逐渐变为不规则多边形,细胞核变形分解,沉默载体组细胞周边伪足伸出减少,细胞皱缩大量凋亡;细胞计数结果显示,转染后培养72 h时,沉默载体组细胞数量极显著低于其他3组（P<0.01）,过表达载体组细胞数量显著低于空白组和阴性对照组（P<0.05）。RT-PCR结果显示,过表达载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）,过表达载体组细胞的GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量均极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞Erβ基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）。由此可初步推测,当HSP27基因过表达时能够促进颗粒细胞增殖分化,当沉默HSP27基因时可能会触发颗粒细胞凋亡进而影响卵泡发育,以上研究成果可为HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的功能研究奠定试验基础。     

PK-15细胞的THBS3基因缺失抑制PRV复制

为探索猪血小板反应蛋白3(thrombospondin 3,THBS3)在PRV复制中的功能，利用CRISPR/Cas9系统构建THBS3基因缺失的PK-15稳定细胞株。首先，根据THBS3基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则设计并合成2对sgRNA序列，退火后连接到Lenti-CRISPRv2慢病毒表达载体；与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(HEK293T)获得重组慢病毒，收集细胞上清并离心去细胞碎片后转导PK-15细胞，进行嘌呤霉素筛选获得THBS3敲除的PK-15细胞株；将重组病毒rPRV-GFP接种至野生型和缺失型细胞评价病毒复制差异。结果显示，表达sgRNA的重组质粒构建成功；将收获的慢病毒转导细胞后通过筛选获得1株无THBS3蛋白表达细胞株(PK-THBS3-KO),通过测序发现外显子3有1个碱基的插入；感染试验显示，THBS3基因缺失后抑制了PRV复制。结果表明，通过CRISPR/Cas9系统成功构建了PK-15的THBS3基因敲除的稳定细胞株，PRV感染试验显示基因缺失后抑制了病毒复制。     

CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39H1/SUV39H2基因敲降

研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞（PEF）中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降，从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs，并以单链寡核苷酸的形式合成，退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接，构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体，用Sanger软件进行测序；将Cas13d表达载体和靶向SUV39H1/SUV39H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞，48 h后收集细胞，用流式细胞术分选检测细胞转染效率，用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率；用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39H1/SUV39H2基因后，靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化。测序结果表明，针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中；流式细胞术分选结果显示，转染效率约70%；半定量PCR结果表明，与对照组相比，3个sgRNAs均极显著降低了SUV39H1和SUV39H2基因的表达（P<0.01），其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50%；Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组；实时荧光定量PCR结果表明，Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组（P<0.05），且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高（70%）。半定量PCR结果显示，转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达，表达量为对照组的25%~30%（P<0.01）。免疫荧光检测结果表明，敲降SUV39H1和SUV39H2基因后，组蛋白H3K9me3水平显著降低（P<0.05）。因此，本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2，并下调其催化的H3K9me3水平。