中国锦紫苏类病毒的检测及其分子生物学特征研究

 从无明显症状表现的11株锦紫苏叶片中抽提低分子量的RNA,经Return-PAGE、RT-PCR和Dot-blot hybridization检测,结果表明11株锦紫苏全部带有锦紫苏类病毒(Coleus blumei viroid,CBVd)。将部分PCR产物克隆到pGEM-3Zf(+)载体上并进行DNA序列测定。序列分析结果,所克隆的序列(GenBank登录号分别为DQ178395、DQ178396、DQ178397、DQ178398和DQ178399)与GenBank中报道的锦紫苏类病毒1号(CBVd-1)序列同源性为85.23%~99.20%。从市场上购买的锦紫苏种子经Return-PAGE和RT-PCR检测不携带锦紫苏类病毒。这是中国发生的锦紫苏类病毒的首次报道。     

一步法RT-PCR检测柑橘鳞皮病毒

柑橘鳞皮病是一种极具破坏性的柑橘病害,广泛分布于南美及地中海地区。我国目前缺乏对该病害的快速检测技术。以柑橘鳞皮病毒(CPV)的外壳蛋白基因(CPG)为靶标,初步建立了一步法RT-PCR快速检测体系,扩增产物与NCBI数据库中已知CPVCPG的核苷酸序列进行比对,2者序列间同源性超过99%。     

不同能量摄入水平对围产期奶牛肝MTP mRNA丰度的影响

将年龄、胎次相同，年产奶量大于7000kg的围产期荷斯坦奶牛30头随机分为3组，每组10头，低能量组（Ⅰ组）按中国奶牛营养标准2000年版减少20％日粮（能量摄入80％），高能量组（Ⅱ组）则按此标准增加20％日粮（能量摄入120％），对照组（Ⅲ组）按标准日粮（能量摄入100％）饲喂，试验从产前28d到产后56d结束，分娩后各组均按标准配制相同的泌乳日粮。分别于产前28、14d及产后1、14、28、56d采取肝活体组织。应用内对照RT—PCR方法检测肝脏组织MTPmRNA丰度。结果显示，各组奶牛肝MTPmRNA丰度均呈现先升高后降低的趋势。产后均高于产前，且产后1～28d差异显著（P〈0．01或P〈0．05），而后回降，至56d趋于平稳（P〉0．05）；Ⅲ组肝MTP mRNA丰度在产后1d达到峰值，而Ⅰ组和Ⅱ组在产后14d达到最大值（P〈0．01）；Ⅱ组产后1～28d显著高于I组。产后14d显著高于Ⅲ组（P〈0．01）；Ⅲ组产后1d和28d显著高于Ⅰ组（P〈0．01或P〈0．05）。这些结果表明，围产期奶牛能量摄入水平对肝MTP mRNA丰度有显著影响。     

鸡传染性支气管炎病毒793/B RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）793／BS1基因序列，设计1对引物，扩增891bp特异性核酸片段，建立了检测IBV793／B的RT—PCR方法。特异性试验结果表明，IBV793／B能扩增出891bp的核酸片段，而IBVM41H120H52毒株以及新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）均无特异性条带出现。敏感性试验结果表明，该方法的最低检出量为10pg的模板。上述结果表明，本试验所建立的RT—PCR方法敏感性高、特异性强。利用建立的RT—PCR方法对从山东省分离的8株疑似鸡IBV793／B进行检测，结果7株为阳性。该方法的建立为IBV793／B的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法。     

猪肌肉组织LPL基因表达的发育性变化及其与肌内脂肪沉积关系的研究

以40-90 kg 6个体重组的莱芜猪和鲁莱黑猪共72头去势公猪为试验对象(每组6头),采用相对定量RT-PCR方法,以-βactin基因为内标,分析肌肉组织LPL基因表达的发育性变化及其与肌内脂肪沉积的关系。结果表明:莱芜猪与鲁莱黑猪肌肉组织中LPL基因表达的发育性变化趋势基本相似,随体重的增长,莱芜猪50-70kg阶段LPLmRNA表达丰度逐渐下降(P<0.05),80 kg阶段迅速回升出现一个峰值后再次下降;鲁莱黑猪LPLmRNA表达丰度随体重的增加呈缓慢下降趋势,70 kg以后变化不大并维持较低水平,其前期(40-60 kg)与后期(70-90 kg)的表达量差异显著(P<0.05)。总体上莱芜猪肌肉组织LPL基因表达量略高于鲁莱黑猪(P>0.05)。相关分析表明,莱芜猪和鲁莱黑猪肌内脂肪相对含量与肌肉组织LPLmRNA表达的发育性变化分别呈显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)的正相关。研究结果提示:猪肌肉组织LPL是肌内脂肪沉积的重要参与者,其编码基因的表达具有明显的体重发育特征,并对肌内脂肪的沉积具有一定程度影响。     

猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果,该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性,而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/μL。对37份现地病料的检测结果也表明该法(检出17份)比常规RT-PCR方法(检出12份)和TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法,检出10份)的敏感性高。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

O型和Asia1型口蹄疫病毒感染RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank中O型和Asia1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的vp3、vp1和2A基因序列,并与其它血清型FMDV的对应基因序列进行比较,设计用于扩增O型和Asia1型FMDV vp1基因的特异性引物,建立O型和Asia1型FMDV RT-PCR鉴别诊断方法。本方法首先用通用型引物进行RT-PCR,确定是否为FMDV感染,然后用特异性引物鉴别O型或Asia1型FMDV的感染。用vp1基因序列分析进行符合性试验,验证了该方法所具有的特异性和敏感性。本方法可用于O型和Asia1型FMD的快速诊断及流行病学调查。     

二温式多重RT-PCR同删两种主要兰花病毒的研究

根据建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cy MV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,建立了二温式多重RT-PCR同时检测两种病毒的检测方法。用该方法对感染两种病毒的植株总RNA模板进行扩增,结果同时得到2条大小与实验设计相符的769bp(Cy MV)、1000bp(ORSV)的特异性扩增带。用该方法对随机抽取的39个蝴蝶兰样品进行检测,结果11个样品检测出Cy MV,阳性率28.2%;24个样品检测出ORSV,阳性率61.5%;6个样品同时检测出两种病毒。     

侵染昆明玫瑰的李坏死环斑病毒的鉴定及其分子检测

采集昆明地区种植的花叶症状明显的玫瑰样品,运用现代分子生物学技术与常规技术相结合的方法,初步鉴定引起玫瑰花叶病的主要病毒病原为李坏死环斑病毒.该病毒引起玫瑰植株的系统花叶、畸形和皱缩等症状;电镜下病毒粒体为球形,直径为22～23nm;ELISA检测发现该病毒在植株芽、花粉和顶部叶片的浓度最高;同时,根据外壳蛋白的保守区利用Primer 5.0设计该病毒的特异引物,对该病毒进行分子检测,得到450bp的预期DNA片断,并在此基础上,进行了巢式RT-PCR的分子检测,表明巢式RT-PCR的检测能力最强.并通过序列的同源性分析得知该病毒的外壳蛋白与已知PNRSV的同源性为98.0%,进一步证明了该病毒为李坏死环斑病毒.