地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α -淀粉酶(α -amylase)的优良菌株。在提取地衣芽孢杆菌基因组DNA基础上 ,通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的全长基因1539bp ,与pUCm -T载体连接转化入克隆菌DH5α中 ,经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌 ,再提取质粒与表达载体pET-28a( )酶切后连接转化入宿主菌DE3中 ,其阳性重组子在37℃1.0mmol·L-1IPTG诱导下 ,α -淀粉酶的基因得到了较好的表达。表达产物经SDS -PAGE鉴定 ,确定表达蛋白的相对分子量为63000左右 ,与理论推导的分子量相一致。     

适配子筛选中随机寡核苷酸文库的构建和PCR条件的优化简

本试验旨在构建用于核酸适配子筛选的随机寡核苷酸文库并对筛选过程中的PCR条件进行优化。利用Primer Premier 5.0构建了随机寡核苷酸文库并据文库两端固定序列设计引物,对对称PCR和间接不对称PCR中的上、下游引物的比例、模板量、退火温度、循环数等条件进行优化并验证其重复性,得到了对称PCR和间接不对称PCR的最佳反应条件,获得较理想的dsDNA和ssDNA并具有良好的重复性。本试验成功构建了寡核苷酸文库,优化了PCR条件,为适配子筛选和后续试验奠定了一定的基础。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域，设计2对引物（1对内引物、1对外引物），进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择，并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明，通过优化试验，筛选到最优反应体系和反应条件；应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验，特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL，比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测，检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法，该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增，灵敏性更高，反应时间更短，检测成本更低。     

猪伪狂犬病病毒检测基因芯片的构建

为了研制猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)诊断DNA芯片,选取PRV g E基因设计引物与探针以构建DNA芯片,同时对基因芯片的探针质量浓度、Poly(d T)的添加、杂交温度、杂交时间进行筛选。结果显示:寡核苷酸探针的浓度在1~30μmol/L之间对杂交信号的影响不大;寡核苷酸探针的氨基化端加上Poly(d T),49.5℃杂交1 h可以获得较好的杂交信号;敏感性试验结果显示,敏感性可达1×10-6ng级,与普通PCR相比高10倍,该芯片具有特异性高、灵敏度高等优点;应用猪伪狂犬病毒检测基因芯片检测20份临床病料,与PCR结果符合率达100%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp2基因并测序.应用DNAStar 7.0、ClustaⅨ 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%.因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近.     

乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法.优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×10⁸ CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案.结果表明,qPCR检测可特异性扩增大肠杆菌,1×10⁸ CFU/mL的大肠杆菌经90 ℃水浴30 s全部致死后,采用10 μg/mL的 PMA暗孵育15 min后冰上曝光10 min为最佳处理方案,这种处理方案可最大程度抑制死细胞信号,而对活细胞几乎没有影响,样品中微生物初始浓度不低于1×10⁸ CFU/mL时较稳定,得到标准曲线回归方程y=-3.356x+47.413,R²=0.9989,最低检测限为10³ CFU/mL,加标样本检测结果与实际相符.该方法为利用PMA-qPCR检测食品中的活大肠杆菌杆菌奠定了基础.     

抗大田软海绵酸单克隆抗体的制备、纯化及其特性

用大田软海绵酸与人IgG的偶联物OA-IgG作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,通过常规细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合,用间接竞争ELISA方法对融合细胞所分泌抗体的特异性进行筛选。经过3次克隆,获得1株可稳定分泌抗OA的杂交瘤细胞株3C5,其染色体数为50±2,所分泌抗体属IgG1亚类,相对分子质量是159390,抗体亲和常数为9.8×108L/mol,滴度达2.56×106。     

环丙沙星人工抗原的合成与鉴定

采用碳二亚胺法将半抗原环丙沙星与卵清蛋白和牛血清白蛋白进行偶联。采用非变性凝胶电泳法和紫外分光光度法对偶联物中环丙沙星与载体蛋白的分子结合比进行分析。紫外分光光度法表明，环丙沙星与卵清蛋白和牛血清白蛋白的分子结合比分剐为6：1和13：1。非变性凝胶电泳显示，即使只有6个环丙沙星分子与栽体蛋白偶联，偶联物在凝胶中的迁移轨迹与栽体蛋白和偶联剂处理的载体蛋白对照样品均有明显不同。结果表明，非变性凝胶电泳法和紫外分光光度法可用于环丙沙星与卵清蛋白和牛血清白蛋白分子结合比的定性分析和定量分析。     

吖啶橙免疫荧光菌团法对肉品和鲜乳中小肠结肠耶氏菌快速检出的实验研究

对应用吖啶橙免疫荧光菌团法(培养法和沉淀法)快速检出小肠结肠耶氏菌的敏感性和特异性进行了实验研究,进而应用先增菌再菌团法的检测程序,对肉品模拟标本和198份肉品和鲜乳实际样品进行了检测,并与常规分离培养法作了对比,证明菌团法于13.5×10~2～10~3个攻/ml以上时,出现典型荧光菌团,与13种杂菌不形成菌团交叉;与杂菌比在1:400以下菌团形成不受干扰;与常规培养法的阳性检出率无显著差异(P>0.05);40h以内即可获得结果,较常规分离培养时间(一般4d左右)大为缩短。