牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

携带猪流行性腹泻病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒的构建与鉴定

旨在构建以乙肝核心抗原（HBcAg）为载体呈现猪流行性腹泻病毒（PEDV）S1抗原表位的病毒样颗粒。将PEDV S1蛋白中含B细胞表位的270 bp片段插入到HBcAg主要免疫显性区域（MIR）,构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,转化到感受态细胞BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定纯化后的重组蛋白,通过透射电镜观察其形态结构。结果显示,成功构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,并在BL21（DE3）中以包涵体形式表达,纯化、复性后的重组蛋白经过2%磷钨酸负染后透射电子显微镜检测到病毒样颗粒结构。HBcAg-PEDV S1重组蛋白能够自发形成病毒样颗粒,在原核表达中,乙肝核心抗原可作为载体呈现PEDV S1抗原表位,为今后新型PED疫苗的研究提供了思路。     

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究

试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。     

目录

为了表达牛环形泰勒虫（Theileria annulata）截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点（pI）为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37 ℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。     

伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究

试验旨在研究伪狂犬病病毒（PRV）在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。     

1株库蠓源版纳病毒的分离与全基因组序列分析

为分析云南省虫媒病毒的种类与遗传特征,在云南省师宗县采集库蠓进行病毒的分离与鉴定;通过全长cDNA扩增与高通量测序技术获取病毒全基因组序列,进行序列比对与系统发生树构建。结果显示,从采集的库蠓样本中分离出1株可在C6/36细胞上引起细胞病变的毒株（YNSZ043）,病毒基因组为分节段双链RNA,琼脂糖凝胶电泳呈"2-4-3"的带型特征;电镜观察可见直径为70~80 nm,呈"指环状",表面具有纤维突起的病毒粒子。全基因组测序结果显示,YNSZ043毒株为版纳病毒（Banna virus,BAV）,基因组大小为20 683 bp,由Seg-1（3 762 bp）至Seg-12（861 bp）12个基因节段组成,与中国BAV毒株各基因节段的核苷酸序列相似性在64.8%~99.6%之间,氨基酸序列相似性在58.8%~100%之间,在系统发生树上YNSZ043毒株与中国分离的BAV聚为一簇,形成独立的中国进化支系。对决定BAV基因型的Seg-12分析结果显示,YNSZ043毒株属于A2基因型,该毒株的Seg-5/VP5与越南分离BAV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性高达97.1%和97.6%,表明该毒株的Seg-5基因节段很可能与越南毒株之间发生了基因重配。研究结果丰富了中国BAV的基因组序列,为开展云南省BAV的流行病学研究提供了参考。     

利用固液分离技术对规模化奶牛场的粪污治理

针对规模化奶牛场的粪污处理问题,利用了固液分离技术,对奶牛场内环境治理,尤其是圈舍内的清粪环节进行减量化改进。从技术角度上优化畜舍内的环境质量,从而弥补国内外现有畜禽养殖业中粪污治理模式中的弱项。本文以天津和润畜牧养殖有限责任公司的规模化奶牛场为试验点,对其产生的粪污进行技术化固液分离,分离后的固体粪便经发酵、晾晒后可作为奶牛的卧床垫料而重复利用。污水经稀释匀浆后储存于贮水池,在采用固液分离技术后,每天的产污水量下降了22%,粪污总量约下降21%。通过技术改进,固液分离处理后的粪污中,总悬浮颗粒物占比降低,污水中总氮和总磷含量降低,化学需氧量（COD）和生化需氧量（BOD）降低60%以上,水质得到提升。固液分离技术可为规模化养殖业提供更加便捷高效的处理粪污、降低污染物含量的产业化排污模式,使规模化养殖产品更加安全健康,同时也可以使人民的日常饮食得到安全保障。     

羊源D型多杀性巴氏杆菌感染小鼠脾脏转录组分析

试验旨在探索羊源D型多杀性巴氏杆菌入侵宿主脾脏组织中引发的免疫应答途径。首先利用羊源D型多杀性巴氏杆菌(HN01菌株)感染小鼠,建立羊源D型多杀性巴氏杆菌感染的动物模型;之后利用转录组测序技术获得感染小鼠与正常小鼠的脾脏转录组数据,并使用COG、KOG、eggNOG、GO、KEGG数据库对测序结果中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行功能注释与分析,同时对于显著富集到关键免疫通路的差异表达基因使用STRING软件和KEGG mapper进行蛋白互作分析,筛选出核心通路中起关键作用的基因;最后选取关键的10个基因进行实时荧光定量RT-PCR验证。转录组分析结果显示,与正常组相比,感染组中筛选出3 380个差异表达基因(P<0.01,log₂|FoldChange|≥0.5),其中1 691个基因上调,1 689个下调。基因功能富集分析结果表明,感染组脾脏中的差异表达基因主要发挥信号转导的功能,其主要参与的生物途径包括细胞因子与细胞因子受体互作通路、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路。蛋白互作分析筛选出约28个核心差异表达基因,结合实时荧光定量RT-PCR验证后,其中9个基因的表达结果与测序一致,分别是C3、Cd4、Cxcl13、Lck、Gnai1、Grap2、IL-6、Cxcr6及Serping1基因。本研究初步证明了脾脏在抵抗多杀性巴氏杆菌入侵中参与了一系列免疫应答反应,为进一步研究羊源D型多杀性巴氏杆菌与宿主之间相互作用的分子机制奠定理论基础。     

基于近红外光谱法的紫花苜蓿品质综合评价

探索近红外光谱法测定紫花苜蓿品质的可行性,采用近红外光谱法与常规方法对8个紫花苜蓿品种(系)的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、钙、磷和干物质等8项指标进行测定。利用配对T检验、多重比较和回归分析等方法检验近红外光谱法测定结果的可行性,运用灰色关联度分析对苜蓿品质进行综合评价。结果表明,粗蛋白、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、磷和干物质等6项指标用近红外光谱法测定可信度较高。紫花苜蓿品质评价指标可简化为粗蛋白、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和干物质等5项。灰色关联度分析综合表现较好的苜蓿品种(系)有WL358、WL440HQ、WL656HQ和WL366HQ。     

Effects of Dietary Crude Protein Levels on Growth Performance,Digestion and Metabolism,and Serum Biochemical Indexes of Super Merino Lamb

The experiment aimed to find out the effects of dietary crude protein levels on growth performance, digestion and metabolism and serum biochemical indexes of Super Merino lamb after weaning.According to the dietary crude protein level, 64 Super Merino weaned lambs were divided into four groups, which the crude protein levels were 13.25%(group Ⅰ), 14.33%(group Ⅱ), 15.53%(group Ⅲ) and 16.60%(group Ⅳ), respectively.The experiment lasted for 60 days, 30 days for the early stage and 30 days for the later stage;And on the 30th and 60th day, blood samples were collected from one head sheep chosen from each replication, and at the end of the feeding test, 3 lambs were randomly selected from each experiment group for a 15 days digestion and metabolism experiment.The results showed that ADFI and ADG in the early and total trial period were significant differences(P<0.05), ADFI and ADG of group Ⅲ were higher than others.The apparent digestibility of nutrients and ME/DE were not significantly changed(P>0.05).In the detection of serum biochemical indexes, there was no significant difference in the earlier stage(P>0.05);At the end of the test, PK and CK showed significant difference between groups(P<0.05).PK presented a rising trend as the protein level improved, CK of group Ⅰ was higher than other groups.In Super Merino lamb early weaning diet, 15.53% protein level in the diet could significantly improve ADG, the apparent digestibility of nutrients, metabolic energy digestibility.At the end of the test, PK and CK were affected by dietary crude protein level significantly.